[医学]In-Fusion克隆技术介绍2012new.pptVIP

In-Fusion克隆技术介绍 February 27, 2018 宝日医生物技术（北京）有限公司 主要内容 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 2 In-Fusion®技术原理示意图 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 3 Clontech专利 In-Fusion®技术特点 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 4 开放性 无缝 克隆 多片段 克隆 In-Fusion 不受载体限制 不受酶切位点限制 不附加任何冗余序列 一次反应 单管操作 阳性率高达80% 主要内容 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 5 实验方法 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 6 In-Fusion®引物设计原则 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 7 平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接 引物的5’末端包含与载体末端相同的15 bp同源碱基序列，3’末端包含与目的基因片段相同/相互补的特异碱基序列 补齐酶切位点缺失碱基 同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15 bp相互补的碱基序列 黏性末端无需进行末端补平 若保留酶切位点，需补齐酶切位点缺失碱基 In-Fusion®引物设计---原则1 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 8 黏性末端 （5’ 悬挂） 黏性末端 （3’悬挂） 平末端 In-Fusion®引物设计原则 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 9 平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接 引物的5’末端包含与载体末端相同的15 bp同源碱基序列，3’末端包含与目的基因片段相同/相互补的特异碱基序列 补齐酶切位点缺失碱基 同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15 bp相互补的碱基序列 黏性末端无需进行末端补平 若保留酶切位点，需补齐酶切位点缺失碱基 In-Fusion®引物设计---原则2 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 10 黏性末端 （5’ 悬挂） 黏性末端 （3’悬挂） 平末端 In-Fusion®引物设计原则 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 11 同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15 bp相互补的碱基序列 黏性末端无需进行末端补平 若保留酶切位点，需补齐酶切位点缺失碱基 In-Fusion®引物设计---原则3 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 12 补齐酶切位点部分缺失碱基 In-Fusion®引物设计在线工具 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 13 PCR引物转换工具 载体线性化 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 14 建立In-Fusion®连接体系 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 15 Linearized vector : Purified PCR fragment(摩尔比)=1:2 *0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ng **10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ng 主要内容 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 16 In-Fusion®应用 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 17 多片段克隆 插入突变位点 构建载体模型 高通量克隆 In-Fusion®应用实例 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 18 In-FusionTM assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-359 In-Fusion®应用实例---多片段连接 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 19 多片段连接---构建真正无缝融合蛋白 将白细胞介素2 (IL-2)分泌信号序列与CD101胞外域序列（删除内源性信号序列）和鼠免疫球蛋白 G3 (IgG3)的可结晶片段进行融合，构建无缝融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并将其转染COS细胞检测表达情况。 实验流程 设计引物； 扩增目的片段及载体线性化； 建立In-Fusion连接反应体系。 In-Fusion®应用实例---多片段连接 2/27/2018 In-Fusion克隆技术介绍 20