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Gibson 无缝连接试剂盒 Cat. No.: D2601 Gibson 无缝连接试剂盒是一种混合酶系统，其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多 个PCR 片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA 连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，可在30 分 钟内实现PCR 片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置，从而获得完整的双链DNA 分子。该试剂盒使用简单， 只需加入合适比例的载体和PCR 片段在50℃孵育15-30min 即可完成片段的连接。 原理 T5 外切酶可从双链DNA5端切割形成3突出末端， 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。 G5 高保真DNA 聚合酶可使退火的片段向3端延伸，从而填补片段缺口。 Taq DNA 连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA 分子。 Fig1：Gibson 组装原理示意图 优势 1. 不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆 2. 不依赖于T4 连接酶，高效连接，无碱基缺失 3. 可同时高效连接一个或多个PCR 片段 4. 无需额外的亚克隆，菌检阳性率高达95% 组分 名称 20T 50T 2XGibson Assemble Mix 100ul 250ul 保存 20℃可保存2 年，-80℃可保存5 年，避免反复冻融。 Web: 免费热线：400-0470-600 Email: order@ 注意：本产品仅供研究用，请勿用于人体及动物的治疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂等用途。 Gibson 无缝连接试剂盒 Cat. No.: D2601 线性化载体制备 （1)酶切获得：单酶切或双酶切均可获得线性化载体，选用的内切酶不同，载体会产生粘末端和平末端；酶切后 的载体进行胶回收后再用于Gibson 组装，这样有助于减少转化时因酶切不完全导致的假阳性克隆。建议使用双 酶切，载体线性化完全，转化背景低。 （2 ）PCR 扩增获得：建议用G7 高保真DNA 聚合酶（HaiGene，A3501 ）进行PCR 扩增载体片段， 获得的产 物建议用凝胶回收纯化以降低转化后的假阳性克隆。在以载体为模板进行 PCR 扩增时，模板的量应控制在 0.1-0.5ng/50μl 体系，从而降低转化背景。一般而言，凝胶回收后，非线性化载体已降低至一定程度，可以直接 应用于Gibson 组装。 *建议通过PCR 扩增获得线性化载体，这样可最大程度的降低转化背景（空载体），提高连接效率和转化阳性率。 插入片段制备 应用G5 高保真DNA 聚合酶（HaiGene，A3201 ）进行PCR 扩增获得插入片段，获得的片段如产物单一条带可 进行PCR 产物纯化回收，否则进行凝胶回收以提高转化效率和克隆阳性率。插入片段的引物设计尤其值得注意， 具体见下一部分。 引物设计 插入片段的引物序列包括重叠序列部分和特异性部分。通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，是 的插入片段的5和3端分别带有与线性化克隆载体两端对应的完全一致的序列，重叠区域的长度一般为 15-25nt， 对于长片段可增加至40nt 同源序列，特异性部分在18-25nt 。 我公司提供引物设计协助服务，设计不熟练的用户，可来信询问（info@ ），我处提供设计和合成服 务。 1. 单个插入片段的引物设计 （1）线性化载体为酶切获得 根据载体线性话方式不同，其末端结构包括5突出末端、3突出末端和平末端三种形式，引物设计也分三种情况， 示意如下： Fig2:酶切获得线性化载体与插入片段连接引物设计示意图 Web: 免费热线：400-0470-600 Email: order@ 注意：本产品仅供研究用，请勿用于人体及动物的治疗、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂等用途。 Gibson 无缝连接试剂盒 Cat. No.: D2601 （2 ）线性化载体由PCR 扩增获得 线性化载体由反向PCR 扩增获得时，要求扩增载体的PCR 引物和扩增插入片段的对应PCR 引物的重复序列在 15-25nt 之间。如只需连接一个基因，可将重复序列分配在载体和插入片段上（Fig3），这样引物易于优化；如需 连接多个基因，为减少载体扩增次数，可将重复序列只设计在载体上（Fig4）。 Fig3 Fig4 2. 多个插入片段的引物设计 多个插入片段引物设计原理同单片段，即相邻片段之间有15-25