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SOUTHERN BLOTTING实验操作流程 小麦基因组DNA的提取 采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。 将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。 S Buffer成分 100mM Tris.Cl pH8.5 100mM NaCl 50mM EDTA pH8.0 2％ SDS 于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。 加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。为有效除去蛋白，此步可以重复）。 用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。 加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。 转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。 待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。 加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min 转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min 转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠 （终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解 待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。 DNA样品可以放在4℃保存备用。 小麦基因组DNA的酶切 通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。 识别6碱基序列的酶 识别4碱基序列的酶 Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha I Sal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq I Dra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf I Eco RI Xba I 如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。 反应混合液： DNA 10μg 10 x Buffer 3μL H2O y μL Enzyme 2μL (ie 2u/ug DNA) 30 μL 除Taq I 在65℃消化外，一般在 37℃酶切约12h（过夜酶切）。 酶切完成后，加入上样缓冲液中止反应（5μL loading buffer/30μL reaction mix）。 短暂离心后上样电泳。 （选择）上样前也可在65℃ 水浴锅中温育1min。 琼脂糖凝胶配制 经酶切后的基因组DNA一般用比面积大（20×25cm）而厚（8 mm）琼脂糖凝胶电泳（6碱基酶切用产物用 0.8% 琼脂糖凝胶，4碱基酶切产物用1.2% 凝胶， 二者都用 l×TAE 配制）。 向将到1L的三角瓶中加入适量的琼脂糖，然后加入400ml l×TAE，称重、记录下总重量，在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解，称重，用蒸馏水补足蒸发的水分，用铝铂纸或保鲜膜封口，于50℃水浴锅中冷却。 用橡皮膏将胶盘两端封住，然后放在水平的实验台上，选择合适的梳子（注意梳齿数，厚度），将冷却到50℃的凝胶倒到胶盘中。 待凝胶完全凝固后，去掉橡皮膏，将琼脂糖凝胶放到水平电泳槽中，加入适量的1×TAE，小心谨慎地拔掉梳子，以免破坏点样孔，影响电泳效果。 加入样品，在室温下以25V电压（稳压）电泳过夜。 当跑在最前端的溴酚兰指示剂移动到15cm时，终止电泳。 电泳结果检测 将凝胶转移到加有EB的浅盘中，染色10-15min。 用蒸馏水漂洗1-2次。 用凝胶成像系统中检测电泳和酶切结果。 转膜 将DNA转移到HYBOND-N+尼龙膜上 (AMERSHA)根据检测结果对凝胶进行修整，用刀片切去点样孔和泳道周围的空白区域。 将凝胶转移到盛有0.25N HC1溶液的浅盘中，在水平摇床上轻轻震荡15min（直到凝胶上的蓝色指示剂变为杏黄色）。 倒掉HCl，用清水清洗一次，然后加入少量0.4N NaOH以中和过量的HCl。 将3张3MM Whatman滤纸（18×27 cm）叠在一起作盐桥，另剪3张3MM滤纸（与尼龙膜大小一致）备用。 向一个水平放置的浅盘中加入适量0.4 N NaOH，然后在浅盘上架一块玻璃板，用浅盘中0.4 N NaOH将盐桥浸湿，再将其平铺在玻璃板上（盐桥两端浸在NaOH溶液中），用玻璃棒赶出盐桥（滤纸）下的气泡。 将凝胶倒扣在盐桥上（正面向下