[工学]2010蔗糖酶课件郑.ppt

酶促反应动力学与 蛋白电泳实验 酶促反应动力学（反应速度及影响因素） pH值对酶促反应速度的影响 温度对酶促反应速度的影响 酶浓度对酶促反应速度的影响 底物浓度对酶促反应速度的影响 激活剂对酶促反应速度的影响 抑制剂对酶促反应速度的影响 在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性, 通常称此pH 为最适pH。 一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。 1 Km 1 1 ??? = ?? ? ??? + ?? V Vmax [S] Vmax 使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： 在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。 不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制) 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应Vmax不变。 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。 七 蔗糖酶米氏常数测定的实验方案 1.将离子交换柱层析得到酶经透析制得E3的稀释至15U/mL，共16ml。 2.取试管8支，按0、1--7编号，0为空白。 3.按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 4.取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 5.于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。 6.按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 7.吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验原理 实验原理 实验原理 注意事项 实验试剂 实验试剂 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂—?-巯基乙醇(?- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基，包裹蛋白形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物，消除不同分子之间原有的电荷差异。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS: 1g 蛋白质。 蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。 在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，可以测定蛋白质的分子量。 电荷效应 实验原理 浓缩效应 凝胶层的不连续性； 浓缩胶：为大孔胶 分离胶：为小孔胶 缓冲液离子成分及pH的不连续性； 电位梯度的不连续性。 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。 分子筛效应 只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋