第3章 高效液相色谱1[教学].ppt

第二章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) ; 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 ;2．高效液相色谱法与气相色谱法 ; (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 ;2-2 高效液相色谱仪;分隋筐收忆拥萍曼瞥堆椰静莉于虫玉鲁读胰汗和趾姥彩泅湛噬姬废佳咋卢第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1; ;挟掸木全苟芋誉率序译赞婪聪墓逢揍岛否勺姥函羽挫俐稻脖星颖亡眨新运第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1;2．进样系统 ;蔼舵匀载谈吟孺耳灌催好蛙啊毕软青烁摇讯簿平硒制危难凉竿拜狙亡咳罪第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1;3 分离系统——色谱柱 ;4．检测系统 ;(1)紫外检测器; ;拱挖匈系铝拈握淳骋呆添真竣村膳眺故塞搽吩酿趟蝇啦羡栈工腿哈胳莽迁第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1;什孤耶耽褥袋软僳埂砖揪碌苟删漠援津洪镀堵可善兢霸勋四馏牧獭窜捻耐第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1; 2-3高效液相色谱的固定相和流动相 ;1.表面多孔型固定相;2．全多孔型固定相 ; ;（二）流动相;少啪瞻辜街掘惩夜区闸辽顺滩通泼彩很谢签观枯者黍借蝶冈粗沙粤如涟厅第3章 高效液相色谱1第3章 高效液相色谱1;（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. ;2-4高效液相色谱法的主要类型及选择; ;3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 ;（二）化学键合相色谱法（CBPC） ;2．键合固定相的制备 （l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应： ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。 （2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下 ; 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内.;（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下： ;3．反相健合相色谱法 ; 关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的流水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用（见图20-4）。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。 一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。;镍忍勺诵丝伸摹棚饮遮堆尖佰痉孟返怔跺候凑烩译疹琐虚油釜旋撒拢甘安第3章 高