第三章-生物样品与样品制备.pptVIP

第三章生物样品与样品制备 教学要求 掌握血样的采集和制备的方法； 掌握离线生物样品制备方法如去除蛋白质方法； 熟悉液-液萃取法、固相萃取法； 了解在线生物样品制备方法。 第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存 一、生物样品的种类、采集和制备 生物样品：包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆液、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。 最常用的为：血浆和血清。 （一）血液 l．血样的采集 目前使用较多的方法是从静脉采血。根据血中药物浓度和分析方法灵敏度的要求，一般每次采血1～5ml。 2．血样的制备 (1)血浆的制备：是将采集的静脉血液置含有抗凝剂的离心管中，混合后，以2500～3000rpm离心5～l0min，使血浆与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆。 (2)血清的制备：采集的静脉血液置离心管中，放置30min到1h。用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去凝固在试管壁上的血饼，再2 500～3000rpm离心5～l0min，上层澄清的淡黄色液体即为血清。 (3)全血的制备：将采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞混合在二起，则称为全血 。 （二）尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研究、药物的尿清除率，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型等。 由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响，常使尿药浓度变化较大。 （三）唾液 标本制备：唾液的采集一般在漱口后15min左右，应尽可能在刺激少的安静状态下进行，用插入漏斗的试管接收口腔内自然流出的唾液，采集的时间至少要10min。 唾液样品易收集，病人易接受，与血浆或血清相比，可避免针头穿刺血管时引起的感染，是一种非伤害性方法 。 适用于药物：卡马西平，苯妥英，扑米酮等。 不适用于药物：苯巴比妥、普鲁卡因胺、奎尼丁、丙吡胺、利多卡因以及抗抑郁药阿米替林、去甲替林锂盐、甲氨蝶呤、乙琥胺等。 （四）组织 在过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器的贮存情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息，常常需要采集肝、脾、肾、肺、胃、脑等脏器及其他组织进行药物检测。 处理方法 匀浆化法 、沉淀蛋白法 、酸水解或碱水解 、酶水解法 。 （五）头发 毛发样品可进行微量元素含量测定，可用于： 药物史的估计 临床用药物和滥用药物的区别 毒性药物的检测 缺点：实验材料的预处理繁杂、干扰多。分析对象的含量低，需要精密仪器测定。 二、生物样品的贮存与处理 (一) 冷藏或冷冻 短期保存时，可置冰箱(4℃)中 长期保存时，须置冷冻柜(-20oC至-80oC)中 (二) 去活性: 为防止含酶样品在采样后酶对被测组分进一步代谢、采样后必须立即终止酶的活性。 液氮中快速冷冻 微波照射 匀浆及沉淀 加入酶活性阻断或抗氧化剂 样品煮沸 第二节 离线生物样品制备 一、生物样品预处理目的 使药物从其缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度； 生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量的，必须先经预处理，使纯化、富集； 为了适应和符合测定方法的灵敏度 ； 为了防止分析仪器被污染、劣化，保证仪器测定的准度、精度和特异性。 二、生物样品预处理应考虑的问题 自学 三、离线生物样品制备方法 生物样品的预处理方法： 有机破坏法 去除蛋白法 分离、纯化和浓集法 缀合物的水解 化学衍生化法 （一）有机破坏法 湿法破坏 干法破坏 氧瓶燃烧法 （二）去除蛋白法 目的： 去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化，还可以保护仪器(如保护HPLC柱不被污染，延长使用期限) 。 1．加入与水相混溶的有机溶剂 原理：加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。 常用的有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。 血浆与水溶性有机溶剂的体积比为1∶1～1∶3时，可将90％以上的蛋白质除去。 通常采用超速离心 (10000r／min)离心l～2min可将析出的蛋白质完全沉淀。 2．加入中性盐 加人中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水分子置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。 3．加入强酸 原理：当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。 常用的强酸有：l0％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。 4．加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 原理：当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉