第3章-物理图谱的绘制.pptVIP

限制性带型指纹 定义：用不同限制性酶消化后，经凝胶分离产生的条带。 重复顺序DNA指纹 定义：将不同克隆的限制性片段电泳转膜后，与基因组范围分布的重复序列杂交形成的带型。 重复顺序DNA PCR或分散重复顺序PCR指纹 定义：运用在重复序列内退火的引物，扩增两个相邻重复序列之间的单一顺序，得到的产物带型。 STS作图指纹 定义：根据STS序列设计引物，扩增文库当中的克隆，能扩出条带的克隆都含有序列重叠的插入子。 STS序列：序列已知的，在整个基因组是唯一的序列 3.3 FISH 指在染色体上进行DNA杂交，以便识别荧光标记探针在染色体上位置的方法 通过原位杂交而绘制的基因或DNA分子标记所在的染色体位置又称为细胞图 荧光原位杂交流程 杂交探针非特异性位点的封闭 中期染色体由于高度凝缩，所以基于中期染色体FISH作的图分辨率低（分辨率1Mb)，中期染色体FISH常用来确定新标记在染色体上的大概位置 用较为伸展染色体FISH作图，可以得到比较精细的图谱 机械伸展的染色体 可区分相隔200-300kb的标记 非中期染色体 分裂间期染色体，分辨率可达到25kb以下 3.4 序列标记位点作图（STS mapping) 前几种作图方法都有缺点 限制型作图快速，但不适合大基因组； 克隆重叠群构建费时费力，指纹作图有时会出现错误； 原位杂交作图操作困难，一次实验定位的分子标记不超过3-4个 STS 作图是构建详细的大基因组物理图的主流技术 序列标记位点STS 指一段短的DNA序列,通常长度在100-500bp,易于识别, 在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠 STS作图 通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中 ， YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因 * 辐射剂量 * 第三章 物理图谱 §3.1限制性作图 §3.2克隆作图 §3.3荧光原位杂交 §3.4序列标签位点作图 §3.5 遗传图与物理图的整合 遗传图的局限性 遗传图的分辨率有限 大基因组的人类及多数高等真核生物不能获得大量的子代 遗传图精确度有限 结构基因组学的发展 genetic mapping physical mapping genome sequencing 物理作图的常用方法： 限制性作图(restriction mapping) 基于克隆的基因组作图（clone-based mapping) 荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 序列标签位点（sequence-tagged sites,STS)作图 3.1 限制性作图 就是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置 限制性作图 Double restriction Partial restriction 切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图 只能应用于较小的分子 通常识别6bp的限制酶适合50kb以下DNA分子的精细作图 大于50kb基因组可采用稀有切点限制酶进行限制性作图 稀有切点的酶分为两类： i. 识别具有7或8个核苷酸序列的酶 如SapI(5-GCTCTTC-3),SgfI(5-GCGATCGC-3) ii.识别序列所含基序在靶DNA中稀少的酶 人类基因组中CG序列很稀少，因此含有此序列的限制酶切点很稀少，例SmalI(5-CCCGGG-3),产生78kb片段，NotI(5-GCGGCCGC-3),1Mb 大片段DNA的分离技术——脉冲凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE) 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场)，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb 正交交变电场凝胶电泳(OFAGE)，有2对电极，分别位于凝胶对角线的两端，2对电极轮流接通和关闭，产生一个交替的方向不同的电场，DNA分子在凝胶中不断改变迁移方向 DNA分子限制性位点的直接检测-光学作图 光学作图：直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点 凝胶拉伸：将染色体DNA悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时DNA分子呈伸展状态。然后用加入氯化镁激活限制酶，切割DNA分子，同时加入荧光染料使DNA分子染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率的荧光显微镜检测到 分子梳理：将硅胶树脂包被的盖玻片浸入DNA溶液中，保留5分钟