〖医学〗质粒DNA的分离、纯化教材-课件.pptVIP

质粒是染色体外的DNA分子,大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子,以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。;质粒DNA－煮沸法;质粒DNA－碱裂解法;　碱裂解法流程图;菌种 :E. coli MV1184(含pUC118)、 E. coli K12(含pEGFP) 设备 :eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机, 涡旋振荡器 试剂:LB液体培养基 、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 、RNA酶A 、饱和酚:氯仿＝ 1:1 ;1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分