小鼠肝脏rna的抽提纯化与鉴定【精品课件】教材-课件.pptVIP

小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定 实验目的 掌握RNA操作注意事项 了解鉴定RNA含量和质量的方法 了解RNA抽提原理 熟悉RNA抽提方法 实验原理 理论基础: 真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达 实验原理:四步骤 组织或细胞匀浆 分离总RNA 纯化RNA 检测RNA的纯度及完整性 理论基础 真核生物中绝大多数基因有内含子,如直接由基因组克隆目的基因,不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。 检测基因在转录水平的表达,需检测mRNA含量,定量RT-PCR是主要方法之一。 内含子 外显子 实验原理 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质,常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提,可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的总RNA。 RNA产物的鉴定 RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。 高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间, A260与RNA浓度呈正比,1 OD = 40μg/ml RNA。 RNA的完整性可通过电泳检测 RNA为单链分子,二级结构复杂,需先经甲酰