免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架教材_课件.pptVIP

免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架;实验目的与要求;一、实验的基本原理;;玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min,室温凉干(或冷丙酮固定5min,室温凉干);PBS漂洗2min×3次;3% H2O2室温孵育10min(以去除细胞内源性过氧化物酶活性);PBS漂洗5min×3次;10%正常羊血清封闭液(0.1M PBS配制)室温封闭20min;弃封闭液(此步骤不必PBS洗涤);; 用适当比例稀释的一抗(一般稀释比为1:100-1:200)37℃孵育1h(或4℃孵育过夜);PBS漂洗5min×3次;用适当比例稀释的二抗(FITC标记的IgG)(一般稀释比为1:100-1:200,用加有BSA的TBS－T配制)室温孵育30min(避光黑暗条件下进行);PBS漂洗5min×3次;甘油/PBS封片剂(PBS: 甘油=1:9,v/v,pH8.0-8.5)封片;荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照。;五、注意事项1. 注意各级抗体浓度的使用范围;2. 荧光抗体孵育时要注意避光;3. 注意各步骤的漂洗要充分.