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厦门医学高等专科学校 药学系 质粒DNA的小量制备 碱裂解法 挑取单克隆、摇菌及菌体的收获 1.5ml培养物12000g离心1min。 吸去培养液上清，使细菌沉淀尽可能干燥。可于-20℃冻存。 一、洗涤菌体 1、将细菌沉淀用0.5ml STE溶液重悬。（剧烈振荡1min） 2、12000g离心1min，吸除上清液。 STE溶液： NaCl 0.1 mol/L Tris-Cl(pH8.0) 10m mol/L EDTA(pH8.0) 1m mol/L (用于洗涤菌体，去除细胞壁等可能抑制酶活性的成分) 菌体重悬 3、将沉淀重悬于100ul 预冷的 溶液Ⅰ中， 剧烈振荡1min；充分混匀。 溶液Ⅰ：(重悬菌体) 葡萄糖 50m mol/L Tris-Cl(pH8.0) 25m mol/L EDTA(pH8.0) 10m mol/L 二、碱裂解--酸中和 4、加入200ul 新配置的 溶液Ⅱ，快速颠倒混匀5次后放置于冰上 1min。不要振荡。 5、加入150ul 预冷的溶液Ⅲ，快速颠倒混匀 5次后温和振荡10s.之后放置冰上5-10min。 三、离心分离，转移上清液 6、于4℃ 12000g离心5min。转移上清液到新管中。记录上清液体积。(上清液含有质粒DNA) *用移液器转移时估计体积 四、乙醇沉淀质粒DNA 7、用2倍体积无水乙醇于室温沉淀DNA。振荡混合，于室温放置2-5min。 8、于4℃ 12000g离心5min，得到DNA沉淀。 9、小心吸去上清液，将管壁的液滴除尽。 10、用500ul 预冷70% 乙醇洗涤DNA沉淀，尽量除尽上清。在空气中使核酸沉淀干燥5-10min。（判断乙醇气味，观察沉淀颜色变化） 五、TE溶解质粒DNA并检测 11、加入100ul TE缓冲液，室温下振荡溶解。 12、测定OD260、OD280，计算DNA溶液的纯度和浓度。 纯度=OD260/OD280 浓度=OD260*50*稀释倍数（单位：ug/ml） 13、取5ul DNA溶液进行琼脂糖电泳检测。 * * 溶解检测 洗涤、重悬 碱裂解、酸中和 离心分离 乙醇沉淀 溶液Ⅲ：(酸中和) -乙酸钾 -冰乙酸 溶液Ⅱ：(碱裂解) -NaOH 0.2 mol/L -SDS 1% （保存于室温）