专题5 DNA和蛋白质技术及专题六.ppt

* 一、实验原理 基本思路:是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1．DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。 2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 3．DNA的鉴定 在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 DNA粗提取与鉴定： 材料的选取 破碎细胞， 获得含DNA的滤液 去除滤液中的杂质 DNA的析出与鉴定 鉴定DNA 加入二苯胺，并沸水浴 DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质 加入冷却酒精（95%） 嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质 加入嫩肉粉 ①NaCl溶液物质的量浓度为2 mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质 ②当NaCl溶液稀释至0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl溶液的部分蛋白质和其他杂质 溶于NaCl溶 液中并稀释 目的 方法 例：下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作。这些操作目的正确的是 （ ） A.①是洗涤血细胞，去除血细胞表面 的杂质 B.②是溶解DNA，去除不溶于酒精的杂质 C.③是溶解DNA，去除不溶于2 mol/L NaCl溶液的杂质 D.④是稀释NaCl溶液，去除不溶于低浓度NaCl溶液的杂质 解析 考查DNA粗提取和鉴定。①是释放核物质，②是提纯DNA，去除溶于酒精的杂质，④稀释NaCl溶液，析出DNA。 答案 C 思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ ①需提供DNA复制的模板 ②四种脱氧核苷酸作原料 ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 ④都需要酶的催化 温度 引物 酶 解旋 相 同 点 高温 体内温和条件 DNA或RNA RNA Taq DNA聚合酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 80~100℃高温解旋，双链分开 在解旋酶作用下边解旋边复制 不 同 点 PCR 细胞内DNA复制 一 、PCR技术的原理 1.利用DNA分子的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 2.体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷 酸、耐高温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 3.复制的方向：子链的5’ 端向 3’端延伸。 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 二、PCR的反应过程 三、实验步骤： 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10分钟 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 例：关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ） A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从 5′端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D.DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸 解析 由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端开始即复制方向由3′端向5′端延伸。由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶的作用下合成的，其合成是从子链5′端向3′端延伸。 C 例：多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。 （1）DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。 （2）PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学