[理学]5 蛋白质的定性定量分析及保存.ppt

印迹法的基本原理 印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。 转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。 目前常用的印迹法有三种： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。 探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。 Western blotting原理图示 蛋白质印迹的用途 用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。 基本操作步骤 样品的制备 细胞裂解物的蛋白定量 细胞裂解物的SDS蛋白质的转移 目的蛋白的检测 免疫印迹技术的注意事项 不能绝对定量，只能相对定量 各样品的上样量必须相同 选择合适的胶浓度 正负电极要确认 充分封闭 驱除气泡 注意保护膜，不能干燥 其它常用的蛋白质分析技术 蛋白质纯度的判定：HPLC、SDS、质谱 蛋白质序列测定技术：Edman测序法、质谱 蛋白质的空间结构测定：X射线晶体衍射分析、核磁共振 在SDS中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式： lg Mr＝lgK－bm＝K1－bm 其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。 注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移 在半对数坐标纸上做出标准曲线 注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。 2. 凝胶过滤层析法测定分子量 蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg Mr＝K1－K2 Ve 在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。 SDS与凝胶过滤法是互补的 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量； SDS测得的是蛋白质亚基的分子量； 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。 例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS（不加还原剂）结果：45kD SDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD） 则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。 3. 质谱法是最精确的分子量测定方法 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。 由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。 第三节 纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存 一、 蛋白质的浓缩 超滤法 使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。 常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。 冷冻干燥法 在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。 注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。 吸收法 采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。 沉淀法 硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。 5.其它方法 浓缩胶浓缩法 离子交换法 吸附法 蒸发法 二、 蛋白质的干燥 常压吸收干燥 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 三、 蛋白质的保存 影响蛋白质成品保存的因素： 1）空气 2）湿度 3）水分 4）光线 5）pH值 6）时间 2.蛋白质的保存方法 低温下保存 制成干粉或结晶保存 在保护