[生物学]23流式细胞术.pptVIP

流式细胞术 内容提要 流式细胞仪的原理 数据的显示与分析 流式细胞仪免疫分析 流式细胞术在免疫中的应用 第一节 FCM的原理(Principle of FCM) 工作原理 FCM细胞分选的原理 1．超声振动器：液流断离成滴 2．液滴充电电路：带电 3．静电高压偏转板：偏转 4．分选细胞的收集装置 染色：荧光染料与细胞成分的结合过程 最常用的荧光染料： FITC、PE、PI 方法： 间接免疫荧光标记 ： 间接免疫荧光标记方法有信号放大作用，但其非特异干扰信号也较强。 直接免疫荧光标记 ： 常用细胞表面标志的染色分析。 注意事项 染色后尽量洗净细胞外的多余染料，减少荧光本底。 温度：低温环境，减少标本的光照射时间 pH：保持荧光抗体的最合适pH值 合适的荧光抗体浓度： 细胞固定剂：某些细胞固定剂有明显的淬灭作用。 细胞自发荧光：吡啶、黄素类核苷酸 1、单细胞悬液制备 方法：实体组织—机械法 温度：25-37 PH： 7.0-7.2 2、免疫荧光染色 温度 PH 荧光染料浓度 固定剂 3、仪器的质控 光路与流路校正 PMT校准 绝对计数校正 4、全面质量控制 阳性细胞或阴性细胞(同型对照）作对照 试剂和操作标准化 开展室内、室间质控评价 四、肿瘤耐药分析 P糖蛋白（P-gp）：跨膜分子，泵出进入胞内的多种抗癌药物。 第三节 流式细胞仪免疫分析 一、免疫检测样本的制备 单细胞悬液内不能有团块及过多的细胞碎片 细胞悬液最适密度为0.5×106-1.5×106个/ml 对不同来源和不同形式的样品，根据其特点 可选择不同的分离方法。 尽快检测。 二、荧光染色 常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PeCy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670 三、质量控制 第四节 流式细胞术在免疫学中的应用 利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。 一、淋巴细胞及其亚群的测定 T细胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Tc) B细胞： CD19+ NK细胞：CD3- CD16+ CD56+ 二、淋巴细胞功能分析 ? CD4+: Th1:CD4+ IFNr+ Th2:CD4+ IL4+ Th0:CD4+ IFNr+ IL4+ ? CD8+: Tc1:CD8+ IFNr+ Tc2:CD8+ IL4+ Tc0:CD8+ IFNr+ IL4+ 活化淋巴细胞亚群 活化总T细胞： 　 CD3+ /HLA—DR+ 静止总T细胞： CD3+ /HLA—DR- 活化CD4+细胞：CD4+ /HLA—DR+ 活化CD8+细胞：CD8+ /HLA—DR+ 　白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞 * * EPICS XL 流式细胞