[生物学]Real-Time PCR 简介.ppt

PCR Real-Time PCR 主要内容 PCR Real Time PCR PCR 各组分及其对反应的影响 PCR的反应条件及其对反应的影响 PCR 常见问题及分析 荧光定量PCR化学原理 荧光定量PCR数学原理 常用荧光定量PCR仪器 Troubleshooting 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction , PCR) PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至ng(10-6)水平 简便、快速 2～4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 PCR 各组分及其对反应的影响 标准PCR反应体系 10×扩增缓冲液 5μl 20mmol/L 4种dNTP混合液（pH8.0） 1μl 20μmol/L 正向引物 2.5μl 20μmol/L 反向引物 2.5μl 1-5U/μl热稳定DNA聚合酶 1~2单位 H2O 28~33μl 模板DNA 5~10μl 总体积 50μl 参照分子克隆实验（第三版） 一、模板 单、双链DNA均可。 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 用哺乳动物基因组DNA做模板时，在每个PCR反应所加入的模板约为1.0 μg DNA，相当于常染色体单拷贝基因的3×105 个拷贝数的量 酵母：10ng、细菌：1ng、质粒：1pg 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加，DNA中的杂质也会影响PCR的效率 标准PCR反应 50μl体系 二、引物 最佳的引物浓度一般在0.1—0.5μmol/L 引物以干粉形式运输，溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了 浓度过高易导致模板与引物错配,导致非特异性扩增 用什么溶解？？ TE: EDTA对Mg2+的螯合效应,对于PCR 的影响 H2O:水的pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解 ddH2O 干粉可以在-20℃下保存至少1年 储存液：100μmoL/L的，分装保存于-20℃，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命） 使用前将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验 三、 DNA聚合酶 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量 0.5-2.5 U/50 l Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 扩增的片段越长，错配的机率越高 从一种生活在热泉（80℃-90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性 耐热的 DNA多聚酶： Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2-10倍 金牌Taq酶经过特殊修饰，常温下其活性部位被封闭，没有活性；只有经过95℃10 min的热启动以后，封闭被解除，才能开始DNA链延伸，这样就最大限度地减少了非特异性产物的生成 四、脱氧核苷三磷酸（dNTP） dATP、dCTP、dGTP、dTTP(dUTP)的混合物 ,四种dNTP浓度应相等 dNTP浓度取决于扩增片段的长度，20-200umol/L dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 浓度过高能加快反应速度，但易产生错误碱基的掺入,非特异性扩增也随之增加 ； 浓度过低则降低反应产量 五、Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 镁离子浓度反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。 六、尿嘧啶糖苷（UNG）酶 UV 照射 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为 大于500bp 300bp 左右 UNG酶的好处 有效地防止污染􀂾 UNG酶能切断所有含dU的双链或单链D