[生物学]克隆.pptVIP

基因工程（上游）大体步骤 1 获得目的基因 1. 直接分离目的DNA 经限制酶切割，电泳分离DNA片断 适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。 真核生物 2. cDNA文库 以mRNA为模板，逆转录合成的互补DNA。以此得到的某种细胞内所有mRNA的cDNA，称为cDNA文库。 3. RT-PCR 基本原理： 将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。 重组DNA 分子的构建 限制性内切酶---粘性末端 EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶， 酶切位点和切割位点如下： 　　5 G↓AATTC 3 　　3 CTTAA↑G 5 限制性内切酶---平末端 DraⅠ AhaⅢ 5 TTT ↓ AAA 3 3 AAA ↓ TTT 5 Eco72Ⅰ 5 CAC ↓GTG 3 3 GTG ↓CAC 5 限制性内切酶---平末端 EcoRⅤ Eco32Ⅰ 5 GAT ↓ ATC 3 3 CTA ↓ TAG 5 HaeⅢ BsuRⅠ 5 GG ↓ CC 3 3 CC ↓ GG 5 限制性内切酶---平末端 SmaⅠ 5 CCC ↓ GGG 3 3 GGG ↓ CCC 5 StuⅠ 5 AGG ↓ CCT 3 3 TCC ↓ GGA 5 单酶切粘末端的双向插入 4 重组子的筛选与鉴定 完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。 当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5－溴－ 4－氯－靛蓝，使得菌落呈现蓝色。 使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。 免疫法筛选 外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可与特异性的抗体结合。 氨基酸序列测定 测定N端的10－15个氨基酸 测定C端的5个氨基酸 样品需精制 价格较高 DNA hybridization ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 利用抗体筛选 原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。 方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该抗体可携带酶或荧光，易于检测。 Screening with antibodies is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available. ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 5 基因表达产物的鉴定 基因表达 基因表达指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译成蛋白质的过程。 研究基因表达的手段 1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质） 1、RT-PCR 基本原理： 将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的 量，判断基因表达的强度。 mRNA cDNA PCR产物 2、Northern blot 标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量， 根据杂交信号位置判断分子长度。 杂交信号 * 获取目的基因 目的基因与载体连接 连接产物导入细胞 目的基因表达 逆转录PCR法 PCR法 直接调用法 各种质粒 各种病毒 皆经改造 原核细胞 真核细胞 哺乳动物细胞 植物细胞 mRNA cDNA PCR产物 Link of cohesive end 粘末端连接 Link of blunt end 平末端连接 vector 1 2 vector 1 2 A A B A B 平齐末端连接时，