[生物学]生物物理课-8.pptVIP

8.膜蛋白的结构研究 膜蛋白的结构研究 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: X-ray; EM 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术:荧光; CD; NMR 膜蛋白的结构研究 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 蛋白的膜拓扑学(membrane protein topology) 蛋白质序列中的跨膜区段，即蛋白质的哪些部位插入膜内 蛋白质在膜上的整体取向，一般即蛋白质的哪一端位于细胞膜的外侧，哪一端位于细胞膜的内侧，以及各部分之间的相对取向 蛋白的膜拓扑学研究 膜蛋白拓扑取向的基本原理 蛋白膜拓扑学研究常用方法 影响蛋白拓扑取向的因素 膜蛋白拓扑取向的基本原理 疏水性原则 膜蛋白拓扑取向的基本原理 正电氨基酸朝内原则 对已知结构的细菌内膜蛋白统计发现，带正电的氨基酸一般位于朝向胞质侧（cytoplasmic），即大部分带正电菏的残基在转运过程中都不能被转运过膜。 只有对长度较短的蛋白片断，正电残基朝内原则才成立（一般不超过60氨基酸），而且在这个范围内，正电氨基酸出现在膜内侧的比例随着片断长度的增加而减少 蛋白的膜拓扑学研究 膜蛋白拓扑取向的基本原理 蛋白膜拓扑学研究常用方法 影响蛋白拓扑取向的因素 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 实验分析： 蛋白水解法 免疫方法 化学标识法 特殊部位定位法 融合蛋白法 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 关于疏水作用 疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！ dS 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！ 当一个疏水性分子（与水分子之间不能形成更强的氢键）进入水相时，由于影响系统自由能的主要是熵变过程，外来分子会发生聚集，以尽量减少其周围有序水分子的数目。表观上看，好象有一种力（疏水力）的作用使它们结合到了一起。 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 实验分析： 蛋白水解法 免疫方法 化学标识法 特殊部位定位法 融合蛋白法 蛋白水解法 将含有要研究蛋白的生物膜制成取向一致 的脂质体（如Inside out Vescicle） ?加入蛋白水解试剂（如Trypsin、Thermolysin等） ? ? 加入抑制剂终止反应 ? 去垢剂溶解膜 ? SDS－PAGE电泳 ?片断分析 蛋白水解法实验中还需要注意： 蛋白水解抑制剂必须有效，有些蛋白酶很难被抑制，而且加入去垢剂后仍然保持活性，这样膜蛋白全部被水解，得不到结果； 可选用多种水解试剂实验，综合所得信息，另外，当实验出现阴性结果时，并不能说明蛋白没有膜外片断，只能说明蛋白没有膜外部分或有膜外部分但该部分没有水解位点； 在电泳检测方面，如果所研究蛋白本身占所用膜上蛋白总量的大部分，则可直接分析各主要电泳带；但若是研究蛋白只占膜蛋白总量的小部分，则必需用单抗或特殊的共价标记物来找出正确的电泳带分析。 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 实验分析： 蛋白水解法 免疫方法 化学标识法 特殊部位定位法 融合蛋白法 免疫方法: 免疫技术的基本思想是使处于脂质体内部的片断受到保护不与外界接触而膜外部分不受保护。由于使用特异性的单抗而使实验结果的分析相对简单。常用的方法是将单抗首先进行同位素标记，反应完成以后将产物电泳然后进行放射性自显影，根据显影带的位置判断抗体是否与蛋白结合。另外如果使用胶体金标记的抗体与蛋白结合后电镜观察，就可以看到其结合部位。 这种方法仍然具有很大的局限性，主要是不能保证抗短肽的单抗一定能和相应的蛋白序列结合，因为该部分序列可能受蛋白质其它部分的影响而采取与短肽完全不同的构象，或者根本就被其它部分包埋而不能被接触。 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 实验分析： 蛋白水解法 免疫方法 化学标识法 特殊部位定位法 融合蛋白法 化学标识法： 通过蛋白上特殊氨基酸能否被位于特定部位的化学标记物标记，可以判断该残基所处位置的。常用的化学标识试剂主要分两大类，即极性试剂和非极性试剂，极性试剂一般认为不能过膜，位于脂质体外，所以可以与蛋白质位于水相的部分反应。而非极性试剂则能插入膜内将蛋白位于膜内的残基化学标记。通常我们事先将化学标记物带上放射性同位素，因此在反应完毕以后可以通过放射性自显影来判断蛋白是否与化学标记物发生了反应。 该法的缺陷在于必须保证化学标记物所处位置的正确性，而且有的标记物能使脂质体发生泄漏影响实验结果。特别对于碘化试剂，由于实验过程中可能产生游离I2，I2能透膜使实验结果失去意义。 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水