[生物学]细胞传代.pptVIP

实验总体安排 一.细胞培养的基本技术 实验前准备 细胞传代 细胞冻存与复苏 细胞计数与接种孔板 二.专题 1.MTT实验 2.细胞凋亡： JC-1 检测线粒体膜电位 3.免疫荧光技术：核蛋白（PCNA)的免疫荧光 4.流式细胞仪的应用：细胞周期的检测 5.电镜 实验内容 1.介绍实验准备 2.细胞传代 3.细胞冻存 细胞培养实验器材准备  目前多数的实验室还达不到用后即弃的条件，常要反复使用一些器皿，在组织细胞培养中器材的清洗、消毒灭菌仍是重要环节，而且工作量很大,是一项繁重而艰苦的工作,其主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。 玻璃器皿的处理 玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带适当电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。为了保证清洗的质量，一般玻璃器皿的处理分为六个步骤：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗、包装、消毒灭菌。 浸泡：新的玻璃器皿首先用清水浸泡及简单刷洗以便去除玻璃器皿表面的灰尘和软化溶解附着物，新购的玻璃器皿表面常呈碱性，并带有许多干涸的灰尘和一些对细胞有毒的物质（如铅，砷等）。然后用5％稀盐酸溶液中浸泡过夜，中和其中的碱性物质。使用过的玻璃器皿常常附有大量的蛋白质，干涸后难以刷洗掉，因此用后就要立即浸入清水中，浸泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。对已用过且有污染的器皿必须先消毒。 刷洗：一般多用软毛刷和洗涤剂或洗衣粉进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。 浸酸：酸就是清洁液，由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水桉一定比例配制而成。具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。 刷洗后的玻璃器皿需干燥后才能浸入酸中，浸泡的时间不应少于6小时，一般浸泡过夜。 表1 清洁液配方 清洁液的配制和使用注意事项 ①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。 ②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。 ③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中)。 ④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。 由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。 冲洗：玻璃器皿经浸酸后，必须彻底冲洗，否则对细胞生长不利。使用流水彻底冲洗，吸管要用流水冲洗10min,器皿用流水灌满、倒掉，须重复10-20次以上，然后，再用蒸馏水漂洗3次，烤箱内烘干备用。 包装：包装的目的是防止消毒灭菌后再次受到污染，所以经清洗烤干的器材应严格包装后再进行消毒灭菌处理。包装的材料常用包装纸，牛皮纸，棉布，铝饭盒，玻璃或金属吸管筒等。包装分为局部包装和全部包装。局部包装用于较大瓶皿，一般用牛皮纸将瓶口包扎好；而全部包装适用较小培养甁皿，吸管，注射器，金属器械和胶塞。 消毒灭菌：包括干热消毒和湿热消毒。干热消毒一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿，需加温到160℃～170℃，保持90～120min方能杀死芽孢。湿热消毒是一种有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是121℃20min，某些培养用液、橡胶制品、塑料器皿等的消毒要求为115 ℃ 10min。 （二）塑料器皿的处理 组织培养常用的塑料器皿包括各种培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要为进口的一次性物品，供应商提供给用户时已消毒灭菌并密封包装，打开包装即可使用。 一些不是无菌包装的塑料器皿，如枪头、离心管等，只要包装消毒就可以使用了。 如果要重复使用塑料器皿，可以按以下步骤处理: 自来水充分浸泡→冲洗→2%Na0H浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次 →晾干→紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa高压灭菌。 （三）胶塞等橡胶类处理 新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→ 自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→ 自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→ 蒸馏水煮沸10min，然后烘干 包装 消毒。 （四）金属器械的清洗 新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应