[自然科学]第7章原生质体的培养.doc

第7章 原生质体的培养 植物组织培养 窗体顶端 窗体底端 原生质体的培养和体细胞杂交 和体细胞杂交（ 学时） 第 7 章 原生质体的培养和体细胞杂交（3 学时） 第一节 第二节 第三节 原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合 本章小结 目的要求： 目的要求： (1)了解原生质体培养的意义 (2)掌握原生质体分离的大致步骤 (3)掌握原生质体培养的方法 (4)掌握原生质体融合的方凑 第一节 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株 由原生质体再生生成植株， 不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢 的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离 出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养 210 个细胞，但在大 田种植需要 4 亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需 1～2 个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因 的激活和失活水平的研究。 在研究分化问题时， 用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千 计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供 新的育种方法。 两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的， 而用细胞融合的 方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分 裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 原生质体(protoplast)的分离 (protoplast) （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从 1960 年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重 要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有全能性，可以经过 离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892 年 Klereker 首先用机械的方法分 离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960 年，英国植物生理学家 Cocking 首先用酶 解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。 他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度 的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至 1960 年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以 后， 植物原生质体研究才成为一个热门的领域。 至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到 原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等 70 种植物的原生质体再生成完整 的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982 年，Klercker 第一次用机械方法从 Stratiots aloides 中获得原生质体.他们的做 法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ① 纤维素酶类：占细胞壁干重的 25％至 50％不等。 ② 半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的 53％左右。 ③ 果胶酶类：一般占细胞壁的 5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。 ④ 崩溃酶：一种粗制酶 ⑤ 蜗牛酶：主要用于分离小孢子的原生质体。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶 C1，作用于天然 的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶 Cx，作用于定形的纤维素， 可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维 素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞 和四分体细胞。 ZA3-867 纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制 品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括 C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素 酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分 离出植物原生质体。 日本产的 Onozuka 纤维素酶常和果胶酶结合使用， 可先用果胶酶降解果胶， 使分开细胞， 再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 (2)酶液的配制 ①酶的配比及浓度(见表 7-1)。 ②渗透稳定剂及 pH。 植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。 去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的 渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。