[自然科学]蛋白质组学讲座.ppt

* * * * * * * * * * * * * (1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。 (2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离)。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。 (6)真核组织的蛋白点有20%的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质;而在原核组织中这样的情况竟高达40??% * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （1）蛋白芯片：目前大多数来自于cD-NA文库的克隆体系不能通过正确的阅读框架编码蛋白质;或者不能正确表达产生具有氨基酸 全序列的蛋白分子；通过细菌表达的蛋白质不能形成正常的空间构象等，不能正确的折叠以及进行磷酸化或糖基化等修饰 （2）通量低，读长，准确性，复杂，提纯，降解损耗，封闭肽，昂贵 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1) 磷酸化蛋白的化学计量值很低。生理条件下，蛋白一般不会100%的磷酸化，所以，只有部分的位点被部分磷酸化，于是蛋白酶解后得到磷酸化的多肽就不会太多，由于带负电，常用的胰蛋白酶常酶切效率不高（因为它酶切位点是带正电的Lys和Arg）磷酸化的多肽在离子源的离子化效率也不高（可能和带负电有关）。非磷酸化的多肽还会抑制磷酸化多肽的信号，这样几步下来，得到的磷酸化就更少了解决方案：A. 在负离子模式下检测磷酸化的多肽B. MALDI-TOF中可以在matrix里加入磷酸，帮助磷酸化的多肽的离子化C. 预先分离和富集磷酸化的多肽在实际工作中，预先分离和富集磷酸化的多肽用得比较多 * 根据swiss prot数据库统计，约一半以上的蛋白质发生了糖基化。对蛋白质的结构和功能有着重要影响，折叠，运输，疾病标志物 人红细胞CD59在一个糖基化位点上有超过100种不同的糖链，而在所有符合N-糖基化位点保守序列的N-X-S/T中也只有约三分之一发生了糖基化，这种糖基化程度的不同使同一肽链因所带糖基的不同而呈现多种多样的“糖形“ * * Combine and proteolyze Affinity separation Quantitation and protein identification ICAT-labeled cysteines 550 560 570 580 m/z 0 100 200 400 600 800 m/z 0 100 NH2-EACDPLR-COOH Light Heavy Mixture 2 Mixture 1 Optional fractionation Protein Quantification Identification Ion exchange LC-MS/MS Enrich for membrane proteins Or Isolate Protein Complexes 没有半胱氨酸 ICAT的反应基团不能连上半胱氨酸 蛋白修饰影响 基团碎片化 只能两两比较 ICAT的不足之处 ITRAQ （isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation） 可同时对四个样品进行标记做定量分析，最近又推出可同时标记8个样本标记的ITRAQ技术；该试剂分子有三个部分组成，报告基团，用于定量，其分子量分别由114-117逐一增加；平衡基团，用于平衡报告基团带来的分子量的差异；反应基团，与氨基酸的N末端反应结合。前体肽段被二级质谱选择后被CID打碎，形成的b离子和y离子用于蛋白的定性，被打断游离出的报告基团用于定量。 Stable Isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) 细胞培养液中去除天然精氨酸和赖氨酸 替代以轻重同位素标记的精氨酸和赖氨酸(13C6, 15N4 Arginine and13C6 Lysine) 或其他氨基酸； 使用去除游离氨基酸的血清 体内标记，更彻底高效 无需化学标记物 无需亲和纯化 在细胞培养的同时完成标记 优势: 细胞中Leu-d3丰度改变 Doubling time of the cells is 24 hrs. Peptide = VAPEEHPVLLTEAPLNPK SILAC Media no Lys and Arg FCS d