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* * 共聚焦激光扫描荧光显微镜 — 基本原理、应用及样本制备原则 宋 健 武汉大学医学院结构生物学研究中心 Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine 什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） ? 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统 共聚焦系统 ? 细胞CT 荧光和荧光显微镜 一、荧光的基础术语 荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长) 488nm 520nm 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。 二、荧光显微镜术的基本原理 荧光显微镜 激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490 紫外 蓝 绿 高压汞灯 被荧光探针染色的生物样本 激发 被标记结构的荧光光学图像 光学 成像 滤镜 分光 488nm 520nm FITC 450nm 490nm 共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置 Laser and electronic Control Unit 激光光源及 控制装置 Computer 计算机 Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 Microscope荧光显微镜 Anti-vibration table 防震台 Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System 共聚焦装置 光源 针孔 检测 针孔 荧光显微镜 光电倍增管 步进聚焦电机 物镜 Bio-Rad LaserSharp 系统操作，图像处理 3-D重建 X/Y扫描 装置 光电倍增管 检测针孔 光源针孔 光源 分色镜 物镜 样本 聚集平面 共聚焦扫描显微镜光学原理 检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 ? 高分辨率的光学切片 激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片 ? 实现三维重建 三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞 共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域 只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类…… 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移?大分子构象的改变、受体与配体相互作用…… 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复?细胞连接间的信息沟通…… 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白 Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 2. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激