环境生物技术519-污染物的生物毒性效应研究方法司.ppt

DNA 呈双链超螺旋结构存在于细胞中, 嘌呤和嘧啶碱基重于螺旋内侧。在DNA 的4 个碱基中, 存在着N、O、P、等原子, 这些原子都含有孤对电子, 容易受到亲电试剂的攻击。 研究表明, 在DNA 分子至少有12个位点易受到化学致癌剂的攻击。 对于大多数致癌物都是经过代谢活化后变成亲电的代谢物后, 再与DNA 发生共价结合的, 但也有直接结合的化合物。 * 　目前最常用的诊断、检测及定量分析加合物的方法, 原理是根据复杂样品中的各组分在流动相和固相间具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,各组分便在两相中进行溶解、吸附、脱附的多次反复分配,达到彼此分离的结果. 这种色谱分离技术与适当的检测手段(如电化学检测器等) 相结合时,就构成了色谱分析法.当前最成熟的联用仪是色谱/ 质谱联用仪。 该法的优点是灵敏度高、特异性强、用于检测极微量加合物的存在及研究其形成机理。 GC-MC 和LC-MC 在分析蛋白质加合物中有重要作用. 毛细管气相色谱与质谱联合分析是目前灵敏度最高的技术之一, 目前已研制出毛细管区带电泳分离与质谱联用技术,并被应用于加合物的诊断、分离和检测。 * DNA加合物的诊断 高效液相色谱法(HPLC) 和气相色谱法(GC) 联合其它敏感的检测法检测DNA 损伤已成为一种趋势。如HPLC- 32P后标记方法是非常敏感的方法。 气/质联用法(GC/MS) 虽然灵敏度稍低，但可以提供加合物准确的结构信息，这一点是其它方法不能比拟的。 目前该方法多用于尿中排泄的DNA 加合物的检测，需水解DNA 才能测定。其敏感性与荧光法相似。 * Gupta 于1982 年就建立32 P 后标记法(32 P-Postlabeling Assay) 来诊断、检测生物体中形成的DNA 加合物. 一种非常灵敏的诊断方法,灵敏度为1 个DNA 加合物/ 1×109～1 ×1010核苷酸.该法的基本原理是,与外源性物质形成加合物的单核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被标记上32 P ,从而通过放射性的定量分析诊断、检测所形成的DNA 加合物. 此法的优点是检测能力强所需DNA的样品量少, 非常适合只能提供少量DNA 的人体样本(几个微克) 的检测, 不需要事先制备加合物标样, 用空白对照可以定量计算加合物含量, 既可用于单一加合物的检测, 也可用于复杂混合物的测定, 及未知的内源性亲电性物质所形成的加合物的测定,应用范围广,可适用于检测不同类型的化学污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不饱和醛类以及活性氧、紫外线辐射等所引发的DNA 加合物,尤其是可用于生态毒理学研究中生物样品的加合物测定以及判断化合物的生态毒性. 其缺点是特异性较差, 步骤比较多, 稳定性不易掌握, 不同的实验室所测定的结果差别很大。在定量水平上存在局限性,因此有必要同其它检测方法结合起来进行应用. * DNA加合物的诊断 Sabtella 等于1988 年创建了酶联免疫吸附测定法(EL ISA) ,该方法用生物大分子加合物抗体(单克隆体或多克隆体) 来诊断、检测靶组织中的相应加合物及其含量,可以在特异的组织或细胞中进行定位研究。 其测定DNA 加合物的灵敏度为1个DNA 加合物/ 1×107～1×108核苷酸。 该方法的基本原理为抗原抗体反应,通常需要结合其它的富集、分离及检测加合物的方法来得出最佳测定效果。 其优点是费用低,简便易行,无须接触高水平的暴露量,适用于大量人群流行病学调查的研究。 其缺点为所需样本量大,抗体间存在交叉反应,对于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能进行检测。 * DNA加合物的诊断 基本原理是抗原与抗体的反应。 已发展的方法有竞争性放射免疫测定(RIA)；固相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)；超敏酶促放射免疫测定(USERIA)等。 其检测限一般为1个加合物/1×107～1×108核苷酸, 目前已有20 多种单克隆多克隆抗体可供使用。 免疫法的优点是简便易行, 价廉, 不需要酶解DNA 链, 用免疫沉淀技术可以将有加合物的DNA 链和无加合物的DNA 链分离，适用于大量人群流行病学调查的研究。 其缺为点是抗体存在交叉反应, 所需DNA 量较大(25～ 60Lg)。另外对于非抗原性加合物和未知抗原加合物的检测无能为力。 * 荧光测定法的原理是通过某些化合物的加合物具有荧光特性而进行定量,其灵敏度为1个加合物/ 106～108核苷酸,所需样品量为100μg左右. 荧光法的优点是不破坏生物大分子链,并可区分出加合物的不同立体异构体及大分子链不同位点上的加合物. 荧光法还可用于研究DNA 加合物的形成或修复与时间之间的动态关系,但不适用于检测发光的化合物. * DNA加合物的诊断 原理是通过某些化合物(特别是多环芳烃) 的D