生物素-亲和素免疫放大技术推荐.doc

第十一章　生物素-亲和素免疫放大技术一、生物素-亲和素系统的特点　　灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。　　　　二、生物素的理化性质与标记　　（一）生物素及其活化　　1.标记蛋白质氨基的活化生物素 N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）　　2.标记蛋白质醛基的活化生物素 酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）　　3.标记蛋白质巯基的活化生物素 3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）　　4.标记蛋白质核酸的活化生物素 常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。　　（二）生物素标记蛋白质　　生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。　　标记方法：（1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用BHZ。（2）标记酶：以生物素标记HRP为例。　　标记注意事项：（1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。　　三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记　　1.亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。　　2.链霉亲和素及其活性：活性基团-色氨酸。　　3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC和胶体金。亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1）HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素-生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素-生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。　　　　四、生物素-亲和素系统的应用　　1.生物素-亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术（ABC）。另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。此外，依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法BAS和间接法BAS。　　2.生物素-亲和素系统可用于酶免疫测定、荧光免疫测定等方法中。　　习题64　生物素-亲和素系统（BAS）的特点有　　A.1个亲和素分子可结合4个生物素分子　　B.1个生物素分子可以结合多个亲和素分子　　C.生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合　　D.亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合　　E.亲和素和生物素有极强的亲和力 　　[答疑编号1] 　　『正确答案』A、C、D、 第十二章　免疫组织化学技术免疫组织化学技术是指组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物。对相应抗原或抗体进行定位、定性或定量检测。其原理仍是抗原抗体的反应，应用酶标记物通过酶与它底物间的组织化学反应生成不溶性颜色产物，用显微镜在细胞或亚细胞水平上观察抗原或抗体的存在、定位及分布。　　 第一节　免疫组织化学技术要点 　　　　一、标本的处理　　（一）标本主要来源　　组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。　　组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。　　（二）标本的固定与保存　　为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70℃冰箱内备用。　　1.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。　　不同