噬菌体展示技术及其在抗原表位筛选中的应用.ppt

噬菌体展示技术及其在抗原表位筛选中的应用 报告人：张瑞华 2010年11月 噬菌体 噬菌体是感染细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的一类病毒，亦称细菌病毒。 噬菌体的结构简单，基因数较少，已成为分子生物学研究的重要工具；另外，因其还可作基因的载体，故又被广泛应用于遗传工程的研究。 噬菌体 Ph.D.由来 1985年，Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了该技术。 1988年Parmley发现已知抗原决定簇与PⅢ的N端融合在噬菌体表面后，可特异性地被抗体选中，因此提出了通过构建随机肽库了解抗体识别的抗原表位的设想。 1990年Scott将噬菌体随机多肽库成功应用于筛选抗原表位，之后国内外学者进行了大量的相关研究，有力地推动了病毒抗原表位的研究进程。 Ph.D.概念 噬菌体展示：将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，进而通过筛选表达有目的肽或蛋白质的噬菌体，得到大量富集，然后通过DNA序列测定进行定性。 因此，噬菌体展示技术堪称表型与基因型的统一。外源蛋白或多肽的表型和基因型被统一在了同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获得其编码基因。 Ph.D.系统类型 根据所用噬菌体类型的不同，又可以分为丝状噬菌体(M13，fd,f1)展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、噬菌粒展示系统等。 T4噬菌体展示系统 1.T4噬菌体病毒颗粒是在宿主细胞内组装，被组装的融合蛋白无需通过质膜，不需要通过分泌途径，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。同时噬菌体还能在体外组装，这对构建表面展示噬菌体十分方便。 2. T4噬菌体展示周期在基于T4生命的非必需衣壳蛋白SOC和HOC。 M13噬菌体展示系统 Ph.D.-12TM噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白（pⅢ）上，因此是一个组合文库。 Ph.D.生物淘洗程序示意图 Ph.D.筛选抗原表位的优点 在抗原表位的研究中，使用噬菌体肽库作为筛选工具的优点： 1. 可以呈现出“靶分子—模拟位”反应的自然态。小型外源肽的定向插入对噬菌体正常的生活周期影响甚微，这有利于表位潜力基因的顺利表达和保持天然的构象。 2. 高通量筛选。噬菌体肽库的库容一般可达109～1012，足以将靶分子的配体从中挑选出来。 3. 易于纯化。由于M13噬菌体是非裂解噬菌体，成熟的噬菌体分泌到培养上清中，可通过沉淀剂将绝大部分噬菌体粒子沉淀下来，从而获得富集的阳性噬菌体克隆。 Ph.D.技术的局限性 作为一种应用工具，噬菌体展示技术也有自己的局限性，主要表现在： 1.该技术始终需要借助于其它的分析系统，如表位预测、蛋白分析、原核表达等辅助性系统以及其他各种设计合理的实验性平台，共同完成抗原表位的精确定位。 2.在该系统中细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；构象型表位由于不具备线性表位的“一体性”结构，所以研究难度相对增大，即使采用富含loops的肽库遴选表位模拟物，与天然的蛋白构象之间仍然会存在些许偏差。 Ph.D.的应用前景 近几年来，噬菌体展示技术在应用研究方面显示出极大的实用性，一些极具应用前景的产品如TPO、抗病毒多肽疫苗、肿瘤相关抗原p53等正处于国际知名公司和研究机构的研究开发之中。 可以预测噬菌体表面展示技术及蛋白质三级结构预测、分子模拟技术的融合，将推进重组抗体、模拟表位、受体作用、酶学机制以及生物疫苗等动物病毒学领域的进程。 谢谢！ * * ？ 噬菌体展示技术 融合蛋白 M13噬菌体展示外源基因模式图 λ噬菌体展示系统 融合蛋白模式图 K = G or T; M = A or C 随机十二肽-gⅢ融合蛋白的N末端序列 文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG (*)可被Gln抑制。 精简密码子表 洗去未结合的噬菌体 洗得特异性结合的噬菌体 包被靶分子并加入肽库，肽库特异性吸附靶分子 于ER2738扩增后进行下一轮淘洗 用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选的结果。每轮淘选所选到的结合序列与?-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。 *