[所有分类]植物育种学汉语班 第十五章.ppt

但是，细胞融合获得的杂种一般在生产上难以直接利用，但这一技术可以为作物育种创造自然界不存在的新资源，对作物育种种质资源的拓展有十分重要的意义。 Protoplasts Isolation and Culture 2、影响原生质体分离的因素 （1）材料来源 叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很容易获得而且遗传上较一致，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。 （2）渗透压 原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。在这种渗透压下，原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。 （3）酶 植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素组成，需要一定的酶组成才能降解它。广泛使用的商品酶制剂可以从很多公司购买。 （4）分离培养基 Ca2+对原生质体的产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁的主要成分，同时能稳定膜结构。另外，Mg2+、PO43-对于原生质体活力的保持也有重要作用，所以分离原生质体的培养基中除酶外，一般含这些离子。 （5）培养条件 酶处理时的温度和pH最重要。PH使用范围为4.8-7.2，可是，高pH（大于6.0）一般有利于原生质体的生存，可能是高pH降低了细胞壁降解时产生的有害酶活性和存在于分离培养基中的毒性物质的活性。为了防止pH的变化，常加入MES[2（N-morpholino）-ethanesulfonic acid]。这是一种缓冲剂，一般使用量为3mM。 （6）组织前处理 高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。  3、原生质体的收集、纯化和活力测定 原生质体酶解完成后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，收集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液同样渗透剂的无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，反复几次，便完成原生质体的洗涤工作。 原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，具体操作方法可参考专业书籍。用Evan’s blue或FDA测定原生质体活力，以确定原生质体的分离效果。 平板培养液体浅层培养悬浮培养液-固双层培养琼脂糖包埋看护培养 二 原生质体培养 1.培养方法 1)原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生。2)原生质体培养一般在22-25℃进行，高、低温都有害。3)培养基无机营养和有机营养组成都对培养效果有显著影响。4)选择适当的渗透压对于获得大量原生质体并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇调节渗透压。5)生长素对于培养早期壁的形成是需要的，最常用的是2，4-D，有时需要生长素与分裂素结合使用。 2.培养条件 三 细胞融合（体细胞杂交）? 原生质体融合技术是实现基因重组的一条途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型，有效地拓宽了植物育种的资源。 Uses for Protoplast Fusion Combine two complete genomes Another way to create allopolyploids Partial genome transfer Exchange single or few traits between species May or may not require ionizing radiation Genetic engineering Micro-injection, electroporation, Agrobacterium Transfer of organelles Unique to protoplast fusion The transfer of mitochondria and/or chloroplasts between species （1）NaNO3处理诱发融合 由NaNO3诱导的可重复、控制的离体原生质体融合。但这种方法存在的严重缺陷就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。这种融合的机制一般认为是Na+造成了膜电位的改变。 1、融合方法 分离的原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以一般要在诱发条件下才能发生融合。 （2）高pH—高浓度钙离子处理 烟草叶肉原生质体在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）条件下能很快诱发融合（37℃），但融合频率不很高，高pH也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合。高Ca2+高pH诱发融合的机制是改变了膜位及膜的物理结构。 （3）PEG（聚乙二醇）处理