[理学]第03章 蛋白质的通性、纯化与表征.ppt

台州学院生命科学与医药化工学院 柯世省 高效毛细管电泳仪实图 4.温度对蛋白质溶解度的影响 在一定的温度范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 （三）根据电荷不同的纯化方法 1.电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(electrophoresis)或离子泳(ionphoresis)。 电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要于段，而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分： 圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电 泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 3.毛细管电泳 毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。 毛细管电泳仪系统 电泳仪 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 * 第3章 蛋白质的通性、纯化与表征 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质是一类两性电解质，能与酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。 天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。 等电点：在某一pH，它所带的正电荷与负电荷相等。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。 等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。 二、蛋白质分子的大小与形状 （一）根据化学组成测定最低相对分子量 如Mb含铁量为0.335%，其最低相对分子质量为： Mb最低相对分子质量＝ 铁的原子量 铁的百分含量 ×100 ＝55.8/0.335 ×100＝16700 Hb最低相对分子质量＝16700×4 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低Mr=35200，实际为69000，含2个Trp （二）渗透压法测定相对分子量 用半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量： Mr＝ RT lim π c c→0 C：浓度（g/m3） R：气体常数（8.314J/(K·mol)) T：绝对温度（K） ?：以大气压表示的渗透压(N/m2) （三）蛋白质的扩散和扩散系数 扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热力学驱动力是熵的增加。 扩散系数D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。 扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。 （四）沉降分析法测定相对分子量 1.沉降速率法 2.沉降平衡法 （五）凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量 （六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）蛋白质的胶体性质 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达尔现象，不能通过半透膜）。 透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。 蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基团数量越多，溶解度越大。 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。 一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。 （二）蛋白质的沉淀 ①盐析法??向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法??破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+.?Pb2+.?Cu2+?等）结成不溶性