Folin酚测定蛋白质含量.pptVIP

生化实验简介及要求 生物化学实验是一门专业基础实验的必修课 目的 培养与提高学生科学实验的能力、自学能力、动手实践能力、表达书写能力、简单设计能力。 任务 通过对实验现象的观测与分析 使学生进一步掌握《生物化学》实验的基本方法和基本技能 加深对《生物化学》理论知识的理解。 试验要求 实验前必须认真预习 实验中观察到的现象、结果和测试的数据应及时、如实记录在实验记录本上 如果怀疑所记录的观测结果或实验记录遗漏、丢失都必须重作实验，切忌拼凑实验数据、结果，自觉培养一丝不苟、严谨的科学作风。 实验报告基本格式 实验名称 （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）实验结果 （六）讨论 (另附实验原始数据,必须有教师的当场签名，严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，反对弄虚作假。) 成绩评定 实验预习、态度成绩（10分） 实验操作(理论)成绩（30分） 实验报告成绩（60分） 实验教材（指导书）、参考书 1、教材 自编讲义 2、参考书 《基础生物化学实验》 王秀奇 等编 高等教育出版社，1999，第二版 生物化学实验方法和技术》 张龙翔 等编 人民教育出版社，1999，第二版 《生物化学实验》，陈钧辉等编，科学出版社，2003，第三版 实验一 Folin－酚法测定蛋白质含量 蛋白质含量测定 临床上诊断疾病 生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。 H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (1) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 优点：能较准确地测定标准蛋白质的含量，干扰少（主要为非蛋白氮）； 缺点：费时太长， 8-10小时，灵敏低，适用于0.2－1.0mg氮。 紫外吸收法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 优点：紫外吸收法简便、较为灵敏（50-100?g）、快速，测定后仍能回收使用 ，不消耗样品，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。 缺点： 1）当待测液的蛋白质中的 酪氨酸残基含量差别较大时会产生一定误差，故该法适用于测量与标准蛋白质氨基酸类似的样品。 2）干扰物质多，若样品中含有其它在280nm 吸收的物质和核酸等化合物，就会出现较大干扰，核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm,两处的光吸收值。 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 原理：1976年由Bradford建立，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究表明，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合形成蛋白质-染料复合物。 优点：灵敏度高,可测定微克级蛋白质,测定蛋白质浓度范围为0-1000ug/ml，测定快速简便（反应只需2分钟），干扰物质较少现已广泛用于蛋白质含量的测定。 缺点：由于不同蛋白质与染料结合颜色深浅不同，用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有一些物质干扰此法的测定，标准曲线也有轻微的非线性。 蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2N-CH＝NH 和 -CH2-NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。 灵敏度差，干扰大，但速度快，操作简便，不需要贵重仪器 Folin—酚法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键(-CO-NH-)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 实验目的： 学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正确使用仪器 材料、仪器设备及试剂 (一)材料：25－250ug 蛋白质 (二)仪器设备：72