ClonePix技术快速筛选和开发高表达GPCR的哺乳细胞系.pdf

ClonePix技术快速筛选和开发 高 表达GPCR的哺乳细胞系 ClonePixTM 2 系统提供了一种全新、快速评估哺乳细胞系GPCR 靶蛋白表达水平的方法  用哺乳表达系统快速评估GPCR 靶蛋白的內源表达水平  增加发现最优细胞反应器的可能性  减少细胞系/抗体开发的时间—避免有限稀释法 背景 哺乳细胞GPCRs 的内源表达通常是非常低的，一般不超过3,000 拷贝/细胞。这些内源 表达水平足够维护正常的受体功能，但在GPCR 药物发现的应用存在挑战。大部分的筛选试 验要求更高浓度的功能 GPCRs 呈现在细胞表面。例如，结构的研究，小分子药物设计和天 然GPCR 的功能抗体生产均需要GPCR 表达水平是内源表达水平的几个数量级。在“低等” 生物中尝试建立表达系统取得的成功非常有限，由于细菌的无效折叠；酵母的低产和杆状病 毒不正确的翻译后修饰。这些挑战激发了药物发现应用中高表达GPCR 蛋白哺乳细胞系的市 场需求。 关于细胞系的开发，从转染细胞库中发现和筛选高表达 GPCR 克隆是非常有挑战的。 ClonePix 技术是已被证明的，一步法快速筛选大量异源细胞（3 周 10,000 个克隆）。由于极 其大容量的细胞库能够被筛选，大大增加了发现最优细胞生产器的可能性。利用白光和荧光 的原位成像技术，ClonePix 2 系统具有足够的灵敏性能够检测细胞表面有限表达的内源性蛋 白。 方法 表达内源G 蛋白偶联毒草碱1 胆碱受体（GPCR-M1）的转染细胞系CHO-M1 被选择来演 示ClonePix2 系统检测细胞表面表达蛋白的可行性。CHO-M1 表达克隆用PE 标记的抗-M1 的 抗体来筛选，ClonePix2 基于荧光强度选择和挑选细胞。野生型的CHO-K1 细胞系作为阴性对 照。客观评价细胞生长及无标记技术的CloneSelect Imager 系统，用来监控ClonePix2 系统挑 选细胞的增殖。FLIPR Tetra 高通量细胞筛选系统和FLIPR Calcium 6 试剂盒用来验证ClonePix2 系统分离细胞克隆的功能。 FLIPR Tetra 系统使用钙敏感荧光报告染料进行高通量功能细胞 测定，是药物发现研究中评估GPCR 激活引起的胞内钙反应的首选工具。 材料  细胞系：CHO-M1 细胞系，表达内源 G 蛋白偶联毒草碱 1 胆碱受体 （ATCC,M1 1 WT3-CRL1985 ）. 亲本CHO-K1 细胞用作阴性对照。  抗体：兔抗ChRM1-PE 标记，多抗 （Bioss，Cat.#ABIN668656 ）; 兔抗-CHRM1 多抗，无 标记；（Bioss ，Cat.#bs-1150R ）; 山羊抗兔 IgG-PE 标记，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP ）。  培养基：Ham’s F12 培养基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV ）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. , 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. 。  反应缓冲液：10X HBSS (Life Technologies, Cat. 无菌水稀释，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. . pH 调整到7.4 。  FLIPR® Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#