P1蛋白质分离与定量.pdf

Protein Isolation and Quantitative Analysis P1 蛋白質分離與定量 莊 榮 輝 雞蛋 的卵白中，含有胰蛋白 (trypsin) 的專一性抑制劑 – 雞卵粘多醣蛋白 (chicken ovomucoid protein, CHOM) 。本實驗以丙酮沈澱CHOM ，離心取得蛋白質並 乾燥後，以Bradford method 測定其蛋白質含量。所得的CHOM 將用在下一個實驗 P2 ，作為親和層析法的專一性配體，以便釣取胰蛋白 ；並且將在膠體電泳實驗P3 檢查其純度。鴨蛋蛋白中也有類似的黏多糖蛋白DKOM ，除了可以結合trypsin 之外， 也可與chymotrypsin 結合，其抽取純化方法與CHOM 相同。 1.1 背景知識 本實驗將展示：(1) 蛋白質的丙酮沈澱法、(2) 高速離心法、(3) 蛋白質脫鹽，以及 (4) Bradford 蛋白質定量法；在以上各步驟操作同時，也要學習(5) 微量吸管的校正 與其正確操作方法，以便奠定生化實驗精確定量的基石。 1.1.1 蛋白質沈澱法 在各種分離方法當中，沈澱法最常用在前面的幾個步驟，尤其有許多方便的沈 澱方法，可以有效地把蛋白質自粗抽取液中分離出來。 a) 硫酸銨沈澱法 ：每個蛋白質的分子表面上，都分布有若干比例的非極性區域， 會凝集許多水分子以便溶入水溶液中；若在此水溶液加入大量硫酸銨，則因為 硫酸銨的高度水合能力，搶走聚集在蛋白質表面的水分子，使得蛋白質表面的 非極性區域暴露出來，相互以疏水性引力結合，並成為聚合體而沈澱下來。 b) 等電點沈澱法：若把蛋白質溶液的pH 調到其等電點，則此蛋白質所帶的淨電 荷為零，分子間的排斥力因而下降，得以互相吸引成聚合體而沈澱。 c) 有機溶劑沈澱法 ：當蛋白質水溶液加入大量有機溶劑，水分子濃度被稀釋， 蛋白質的溶解度便迅速下降，因而得以沈澱下來。 但因為有機溶劑與水混合 後會產生熱，容易造成蛋白質的變性，因此要在極低溫下操作。常用的有機溶 劑有丙酮或甲醇，在沈澱後也常用乙醚來帶走丙酮，以加速乾燥。 生物化學實驗 P1-1 蛋白質分離與定量 P1 d) 另外，三氯醋酸(trichloroacetic acid, TCA) 是很強的蛋白質變性劑，許多蛋白 質遇到TCA 都會變性沈澱，無法再恢復原態。因此，TCA 對皮膚有很強的腐 蝕性，不小心接觸後要馬上沖水。通常TCA 並不被用在純化蛋白質的步驟中， 而是用來沈澱或移除大部分蛋白質。 1.1.2 高速離心法 離心是分離固態與液態最方便的方法，因此蛋白質以上述方法沈澱下來後，接 著便可用高速離心法，把形成固態或半固態的蛋白質分離出來。這樣的離心都 要在低溫下進行，以免離心時產生高溫，也可保持蛋白質免於變性。在生化實 驗室中，高速離心機是較危險的儀器，一定要注意離心管是否正確平衡，離心 轉速是否設定正確。 第一次操作任何離心機時，一定要有熟練的人員在旁監 督，以免發生危險。 1.1.3 蛋白質脫鹽 脫鹽是一種重要的生化操作，可以把小分子與巨分子分離開來，是生化實驗常 用的步驟，通常脫鹽效果的好壞，對下一步實驗有決定性的影響。有下面幾種 方法可以應用： a) 透析袋 ：是最常用的方法，透析