基因组DNA文库cDNA文库.ppt

3’ RACE 5’ RACE B. 新 RACE 连接RNA寡聚物 AAAAAAA NNNNNNNN 反转录 GSP1 (3). 其它与克隆有关的方法 如Okayama-Berg 法和引物-衔接头法 第三节 基因克隆的筛选策略 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤 二、杂交筛选 核酸探针 目的基因：未知功能的基因 不能在原核生物中表达的真核生物 的基因 探针来源：高度保守的基因 rRNA基因 邻近种属的相应基因 不完整的蛋白质产物设计简并探针 菌落杂交和噬菌斑杂交 三、免疫筛选 ?使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。 适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的 DNA 文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组 DNA 文库和真核生物的 cDNA 表达文库。 所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。 原位检测 免疫沉淀 本章小结 ?基因文库的定义：指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。 按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA library）。 本章小结 ?基因文库构建的基本程序包括： 1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌 4、阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 本章小结 cDNA 第二条链的合成在 cDNA 文库的构建中非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引导合成法，引物－衔接头合成法可以合成 cDNA 第二条链。 文库构建以后可以通过表型筛选法、杂交筛选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 一、 RNA 的分离 cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小（1%-5%），因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。 目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将 mRNA 从其它组分中分离出来的 1. mRNA 的分离 2. mRNA 的丰度 高丰度 mRNA （abundant mRNA） 约有几十种, 5000拷贝/cell 珠蛋白 免疫球蛋白（immune globulin） 卵清蛋白（egg albumin） 在特定细胞中占50-90% 中等丰度mRNA 1000-2000, 200-300拷贝/cell 低丰度 mRNA （low-abundant mRNA） ＜0.5%，被称为低丰度 或稀有mRNA 1-15拷贝/cell 文库应足够大，鉴定和分离困难 二、cDNA 第一链的合成 由 mRNA 到 cDNA 的过程称为反转录，是由反转录酶（reverse transcriptase）催化的。 常用的反转录酶有两种： AMV ：来自禽成髓细胞瘤病毒，42℃，RNase H 活性强 M-MLV ：来自 Moloey 鼠白血病病毒，37℃， RNase H活性弱，反转录长的mRNA 二者都是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，有 5’→3’ DNA 聚合酶活性。 引物： Oligo（dT）和随机引物。 Oligo（dT）引物一般包含 10～20 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含 6～10 个碱基的寡核苷酸短片段 模板：氢氧化甲基汞预处理，减少链内二级结构 RNase 抑制剂 mRNA cDNA第一链的合成 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TT