乙肝疫苗免疫实验设计教学课件.ppt

免疫实验设计 ——脂质体佐剂对增强HBsAg 免疫原性的作用 立题依据： 中国属于HBV感染的高流行区 ，普通的乙肝疫苗产生的抗体有一定的年限，所以需要研制一种疫苗能够延长记忆B细胞存在时间，且注射疫苗后抗体检测阳性率增加，避免注射后抗体不产生的可能性。疫苗免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体因此常在疫苗中加入佐剂，可以延缓抗原释放率，延长免疫反应，提高记忆细胞的数量，能够聚集抗原，有效提高免疫球蛋白受体的聚集度。 研究内容： 1.材料与方法 1.1 试剂及动物　小鼠IL-2 检测试剂盒为深圳晶美生物工程公司产品, 小鼠IFN-γ 检测试剂盒为Bender Medsystems 公司产品, IL-5 检测试剂盒为ENDOGEN 公司产品, HRP 标记的羊抗鼠IgG1 及IgG2a 试剂由上海生物制品所刘庆良研究员惠赠。乙肝表面抗体检测试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。DC-Chol 本实验室自行合成, 具体合成方法参阅[1] 。BALB/ c 小鼠购自第一军医大学实验动物中心。 1.2 基因重组乙肝表面抗原 酵母表达的基因重组HBsAg 由深圳康泰生物制品有限公司提供, HBsAg 含量为60μg/ ml , 其中不含佐剂的纯化HBsAg批号为S013021。含铝佐剂的HBsAg 批号为T010601。 1.3 DC-Chol 正电荷脂质体的制备和形态观察 称取DC-Chol 20 mg 放入圆底烧瓶内, 加氯仿2 ml 使其完全溶解, 上旋转蒸发仪, 室温, 30 r/ min 压力0.09 Mpa , 蒸干后置干燥器抽真空15 min 后保持过夜。加缓冲液(20 mmol/ L Tris-HCl , 150 mmol/ L NaCl ) 8ml , 4 ℃通氮气搅拌过夜。以乙酸双氧铀负染法制备样品, 用透射电镜观察其形态大小, 并计算粒径大小。 1.4 脂质体与HBsAg 结合率及稳定性观察 将60μg/ml 的HBsAg 和2.5 mg/ ml 的DC2Chol 脂质体制成混合物, 其中含HBsAg为4 μg/ ml , DC-Chol 为1.6 mg/ ml。高速离心后用ELISA 法分别测上清和沉淀中的HBsAg 量, 计算出结合率。 　 1.5 　小鼠的免疫和检测　取4～6 周龄BALB/ c 小鼠36 只, 雌雄各半, 均分为三组, 每只鼠均皮下注射不同制剂0.25 ml 。对照组注射4μg/ ml 不含佐剂生理盐水稀释的纯化HBsAg。铝剂HBsAg 组为用铝稀释剂稀释成4μg/ ml 。脂质体佐剂组注射HBsAg 1μg , DC-Chol 0.25 mg 混合物。在第1天和第21天分别免疫两次, 并于第一次后第21天及第42天、63天三次尾尖采血分离血浆, -20 ℃保存待测特异性IgG 亚型IgG1 和IgG2a , 用酶标仪读取A 450 nm/ 630 nm双波长值代表抗体滴度的高低。 2.预期结果： 2.1 脂质体的形态、稳定性以及与 HBsAg的结合率 空白脂质体4℃放置2周后呈半透明均匀的悬浮液, 1个月后有极少量颗粒状沉淀, 3个月后沉淀无明显增加。取4℃放置1个月的脂质体经染色透射电镜观察, 以圆形为主, 个别为椭圆形, 颗粒均匀。(图1)脂质体与HBsAg 结合率基本稳定。 2.2 　不同佐剂疫苗诱导产生的特异性抗体应答水平 将受检血浆用抗凝生理盐水作100 倍稀释,ELISA 检测结果如表1 所示。脂质体佐剂组IgG1的A 值和IgG2a 的A 值远超过铝佐剂组。 （说明脂质体佐剂能明显增强体液免疫和细胞免疫, 对机体的特异性细胞免疫功能具有良好的促进作用。） 脂质体佐剂组IgG1的A 值和IgG2a 的A 值远超过铝佐剂组 2.3 免疫小鼠脾细胞产生的细胞因子水平 经不同疫苗免疫后小鼠脾细胞经HBsAg 刺激后产生的细胞因子结果(表2) , 脂质体佐剂组产生的IL-2水平、IFN-γ的水平以及IL-5 的水平均远高于铝佐剂组。 （说明对Th1 和Th2 类的细胞因子均有显著的提高。） 3 .讨论 本实验所用由DC-Chol 制备成的正电荷纳米脂质体, 粒径控制在50~300 nm 之间, 增加了其稳定性, 存放3个月后外观无显著性的变化, 克服了以往脂质体制剂稳定性差的问题。另外, 采用将带负点荷的疫苗吸附在脂质体的表面的策落, 吸附率达90% 左右, 克服了以往只是将药物或疫苗包封在脂质体内而使包封率难以提高的缺点, 实践证明这样的方案同样可以达到促免疫增强作用[2] 。选用DC-Chol 为原料克服了如脂质A、福氏佐剂等毒性大的缺点。有研究表明DC-Chol 的毒性较小