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荧光定量PCR实验技术讲座 简 介 工作原理 试 验 注意点 ? * * 报告人：徐 歆 2013. 3. 20 主要内容 简 介 什么是荧光定量PCR？ 在PCR反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA 量的增加 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 荧光定量PCR 结果可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA 拷贝数），即qPCR 工作原理 工作原理（SYBR? GREEN） 工作原理 x-轴表示PCR 循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系 工作原理 到达相同荧光强度（R）需要的循环数（CΤ）越小，则初始模板量越多 试 验 试 验—引物的设计 NCBI Genbank查询目的基因mRNA序列 根据mRNA序列中的CDS设计引物 要求：17 ~ 24 mers，CG = 40~ 60%, Tm ≈ 60℃ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡结构 Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出1000 bp以下的非目的产物 试 验—cDNA样品的制备 提取Total RNA（培养细胞或组织） 保证RNA质量（OD260/OD280 = 1.8~2.2） RNA尽快反转录为cDNA 按实验方案稀释cDNA 试 验—加 样 根据待测样本及目的基因计算反应孔数目，选择96孔反应板或8联管