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基因突变分析技术研究进展 摘要： 基因突变(gene mutation)或点突变(point mutation)是组成遗传物质的DNA分子中碱基的变化，这种变化是无法用显微镜直接观察，但能在基因水平上检测的或通过遗传学实验来证明的、能遗传的改变。基因突变可发生在个体发育的任何时期，发生在体细胞时，可引起生物体的异常或得肿瘤；发生在生殖细胞时，引起遗传病。基因突变分析是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键步骤, 也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段, 本文对多种基因突变分析技术进行了分类综述,并对毛细管电泳在基因突变检测中的应用进行了详细介绍。 关键词：基因突变；分析技术 ；应用 据估算人类基因组中约包括5～10万个基因,它们分布在24个不同染色体和线粒体上,到1998年1月为止,已克隆的人类功能基因达到5052个,但确定与某一特定遗传病相关的基因只有821个,目前已被认定的孟德尔遗传病1402种,这些病都至少与一个或几个基因的突变相关。研究人类的全部基因,特别是与疾病相关的基因的结构、功能以及各种基因突变与疾病的关系,是人类认识遗传病的发病机理,并最终达到对遗传病进行基因诊断和基因治疗的重要环节。 从20世纪80年代开始,一系列寻找新基因的方法得以应用,但要确定哪一个基因是该病的致病基因, 还需在相应的病人中进行突变检测。在过去的十几年中, 虽然已有多种突变分析的技术得到发展,但总的来说,寻找一种快速、高效而又经济的方法仍然是很多科研工作者的研究目标。本文对突变分析的种种方法进行了分类综述。 突变分析技术按其研究对象主要分为两大类,即:①对未知突变进行分析,即确定某一未知基因与某遗传病的关系；②对已知突变进行分析,即在临床上对致病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。在实际应用中许多检测未知突变的方法也可用来对已知突变进行检测。 对未知突变进行分析的方法 化学切割错配(chemical cleavage of mismatch, CCM) 化学切割错配是在Maxam-Gilbert 测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA 异源杂合双链核酸分子中，错配的C能被羟(hydroxy lamine)和哌啶(piperidine)切割, 错配的T能被四氧化锇(Osmium tetroxide ) 所切割, 切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变【1】。只要操作得当,不会发生非特异性切割, 如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达100%； 使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb的片段进行分析, 并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。 单链构象多态性( Single-Strand Conformational Polymor phism, SSCP) 该方法的原理是【2】:单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使是一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。由于SSCP法简单快速，因而被广泛应用于未知基因的突变分析和临床检测。该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变,由各实验室报导的突变检出率从99%到35%不等。由于随DNA 片段大小的增加,迁移率的改变明显减小,故而该方法只适合用来检测150～200bp的DNA片段。一般来说对小于200bp的片段其检出率可达90%,而对大至400bp的片段,其检出率可能只有70%～80%。同时该方法要求多次摸索条件,如电泳温度,胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。至于突变类型,除G到T的置换外,似乎对其检测的灵敏度并无大的影响,此外,该方法不能确定突变的精确位置。尽管如此,由于SSCP的使用简单便利,科研工作者在应用中对其进行了不断地改进,这些改进包括:优化电泳条件,多重PCR的使用,对较大片段的PCR产物先进行酶切消化再跑电泳,毛细管电泳取代普通胶电泳以及自动测序仪的使用等。尽管这些改进增加了该方法的复杂度和花费,但却使SSCP 的检出率大大提高,接近于100%。此外，使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度,尤其是对大于200pb 的片段。 RNA酶A切割(Rnase A cleavage) 在一定条件下,异源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的错配碱基可RNase A切割, 切割产物可通过跑变性胶得到分离。RNA探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到,当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时,RNase A 在错配处的切割效率很低甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。所以如果仅分析被检DNA 的一条链, 其突变检出率只有30%,而如果同时