血片制作染色与疟原虫计数.pptVIP

疟疾血片的制作、染色、镜检 宣恩县疾病预防控制中心 2012年4月 检出疟疾的病原体--疟原虫,是明确诊断的最直接证据.目前常用厚\薄血膜法,因其具有操作简便\敏感\价廉和可鉴别虫种等优点,广泛用于疟疾的病原学诊断已近一个世纪,显微镜检查是疟疾诊断的金标准,且也是目前最常用的方法之一. 血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。 血膜的制作（取血时间） 取血时机 疑似疟疾时,应在病人发热时采血. 疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后6~8小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 患者刚开始发作时原虫密度很低,血检时可能查不到疟原虫,应在第二次发作时再次血检以免漏诊. 血膜的制作（取血操作） 取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。如采用静脉血，用针头滴一点血在玻片上。 取血量及涂片法（涂片操作） 薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，从右向左迅速向前推成舌状血膜.推片时，用力不均，则易成波浪起伏状；用力太大，则血膜两端过厚，中间过薄；若玻片上有油腻，则所涂的血膜很不均匀而成多孔状。 （涂片操作） 厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4.5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。 血膜的编号 血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔（或油性记号笔）在玻片标签上写上受检者的编号，以防差错。 注意：血片编号要与血检登记簿上编号一致！编号由5位数字组成，前2位为所在地前二字的声母简写，后三位为阿拉伯数字。如李家河1号血片编为为LJ001，沙道为SD001…… 制作血膜的注意事项 1.新购玻片清洗须清洗干净，或者用95%乙醇浸泡5-10分钟，擦干备用。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。 制作血膜的注意事项 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。 制作血膜的注意事项 3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤（可致血红蛋白凝固而无法脱落），干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。 血片的染色（一）染液的种类及染色原理 染液种类：目前所用的血片染色液有瑞氏和吉氏染液及瑞吉氏复合液等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青。 血片的染色（一）染液的种类及染色原理 染色原理：疟原虫染色原理是染料与被染物的阴阳离子想到吸附而结合的一种化学反应。各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸组成。主要染料都含有美蓝、红和美蓝氧化后的天青。伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱