现代分离提取——电泳.ppt

引 言 电泳的概念：带电物质在电场中向所带电荷相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现, 但电泳技术的广泛应用是在1937年，纸电泳 1937年瑞典化学家运用电泳成功分离血清蛋白，获得诺贝尔化学奖。 近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 电泳的分类 原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为五种： ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：用醋酸纤维素薄膜作为支持介质，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，电泳结果重复性差，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前最常用的支持介质 第一节 电泳的基本原理 电泳的基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 要考虑选用离子强度适宜的溶液。 溶液的离子强度越高，泳动速度越慢，反之越快。 电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、温度、溶液粘度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。 电泳系统的基本组成 电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦3000~8000V 外循环恒温系统：高电压会产生高热，需冷却； 凝胶干燥器：用于电泳和染色后的干燥； 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。 电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上。 电泳洗脱仪：回收样品。 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。 凝胶电泳 作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、对电泳过程无干扰，化学稳定性好、均匀、重复性好、电渗小等特性。 凝胶电泳的支持介质 聚丙烯酰胺凝胶（PGA） :由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成； 琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖； 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附、电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同主要有： 1.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.聚丙烯酰胺凝胶 4.等电聚焦电泳 5.双向电泳等 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 凝胶电泳优点：电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力,这种现象被称为分子筛效应。 分子筛效应 二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 影响聚合的主要因素 引发剂和增速剂的浓度：浓度小聚合速度慢；浓度过大易导致烧胶、电泳带的畸变；一般控制使聚合在40~60分钟内完成。 系统pH值：一个最佳pH值，获得最佳的聚合结果； 温度：低温变脆和混浊；提高温度使凝胶透明有弹性； 分子氧：阻碍凝胶的化学聚合；抽气或灌水； 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； 在浓度为7.5% 的凝胶，生物体内的蛋白质大多能满意的分离效果。把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7