分子克隆技术讲解课件.ppt

植保生物技术讲座05 第五讲 分子克隆技术 克隆载体 是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力.2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片段。 pBR322 pBR322 pBR322是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。 四个重要位点 (1) 负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进不稳定的 RNA?I – RNA?II 复合体转变为稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋白的tet基因 (来自 pSC101). pUC系列质粒 是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。 pUC19 pUC18 和 pUC19 小、高拷贝数, 长2686?bp 只有多克隆位点(MCS)排列方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变，因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的lacZ基因的5‘端(来自 M13mp18/19).。这个多肽片段的合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实现 alfa互补。 pUC18和 pUC19 pUC19图 pBluescript II系列 均为2961?bp 长，用于DNA 克隆、双脱氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方向不同。 pBluescript?II载体上的重要位点 (1) f1 (IG) –噬菌体 f1的基因间区; (2) rep (pMB1) –pMB1 的复制子，负责质粒的复制； (3) bla (ApR) –编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性; (4) lacZ基因的 5’-端 序列，编码编码beta-半乳糖苷酶的N-端多肽，有了这个这个多肽片段，就可以菌落蓝白反应对重组质粒进行筛选 pBluescript II KS/SK pBluescript SK M13mp18 和 M13mp19 载体 单链、雄性专化的DNA丝状M13的衍生物。两个载体均为 7250?bp 长，其多克隆位点方向相反 。 在 E.coli 操作元 lac 区含 CAP 蛋白结合位点、 启动子 Plac、lac 阻遏蛋白结合位点和 lacZ基因的 5’-端 序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆位点取代)。 M13mp18/19结构图 多克隆位点 Lambda噬菌体 Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。其 DNA 是线状的、双链的 (48502?nt)，两端的5’-端有12?个碱基是单链的，碱基互补的。噬菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。在溶原循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA通过重组插入到细菌染色体中。 Lambda噬菌体唯一切点 Lambda噬菌体