磷酸化蛋白质生物探索.pptVIP

2．液相色谱电喷雾串联质谱 串联质谱测定糖蛋白的氨基酸序列 对于已知蛋白，用串联质谱的方法，可以测定蛋白质氨基酸序列中间某一片段，从而判断其序列与理论序列是否一致，这一方法完全可以被延伸至糖蛋白的一级结构分析中来，可以将糖蛋白酶切后的肽段，包括含糖肽段，在串联质谱上直接选择离子进行碰撞活化，从而分析选择肽段的氨其酸序列，得到糖蛋白的一级结构信息。 糖链结构的分析 随着电喷雾申联质谱仪器的发展，目前最直接的分析糖链结构的方法是应用串联质谱的母离子扫描(parent ion scan)技术，选择特定的糖链离子．经碰撞活化室用惰性气体将其打碎，从而推断糖链结构。 3.凝集素在糖蛋白分析中的应用 凝集素不但可用于寡糖或糖复合物的分离纯化，也可用于糖链的结构分析，比如：伴刀豆球蛋白(ConA)对高甘露糖型N-糖链有专一性；麦胚凝集素(WGA)却对杂合型N-糖链有专一性；而亲和核心岩藻糖类糖链应选用兵豆凝集素等。以核糖核酸酶B为例，用比ConA提取其高甘露糖型糖链。 六、小结 蛋白质的翻译后修饰，包括糖基化，对于发生在生物学体系中的新陈代谢具有控制作用，多糖结构中存在着可利用的广泛的差异性．这些差异性对于新陈代谢的调节细致入微。2D展示的糖蛋白阵列为我们提供了一个谱图，由它我们可以探索疾病发生、发展过程中的变化。重组糖蛋白由于其能够提供足够的样品量．应用质谱以及相关技术的分析工具已经能够较完善地鉴定其结构。 * 前述的固相金属离子亲和色谱法也是选择性检测磷酸肽的方法。它有一个好处是可以直接用MALDI-TOF-MS分析，即直接用此IMAC填料与肽混合物共孵育，使磷酸肽与色谱填料结合，离心后填料与磷酸肽共同沉淀在底部，弃上清，将沉淀清洗几遍后，可直接与MALDI-MS的基质溶液混合并进行质谱分析。或者使用IMAC柱将磷酸肽富集洗脱后质谱分析。通过比较IMAC处理前后肽谱的变化找到磷酸肽。 用MALDI-TOF-MS分析ZipTip处理前后的肽段 m/z 2061.9 33到48位，序列为FQSEEQQQTEDELDK，该肽段质荷比的理论值为m／z 1981.9，但是在其中的第35位丝氨酸残基上有一个磷酸基团，使该肽段的质量数增加了80而成为质荷比为m／z 2061.9的峰 (3) 磷酸化氨基酸位点的确定 要确定其磷酸化位点，需要用串联质谱产物离子扫描模式（product ion scanning)对磷酸肽进行序列分析。 MS/MS spectra Trypsin GTVQPASNFNDDSSQGLGTDEGSIVLTQR GTVQPASNFNDDSSQGLGTDEGSIVLTQRSNAQAVEGAGTDESTLIELMATRILVSLALGNRDEGPENLTQAVVAETLNKLLALXGGDDFKLMAAG 将选定的磷酸肽在碰撞诱导解离(CID)室打碎。检测其产生的全部碎片离子，根据碎片离子质量数推断肽段序列和磷酸化位点。磷酸肽在CID室碰撞诱导解离．易产生丢失80 Da(HPO3)和98Da(H3PO4)的子离子，此离子峰的丰度很高，往往在整个碎片离子谱中占据主导地位。一般较短的磷酸肽比较长的磷酸肽更易于丢失磷酸． 磷酸肽的串联质谱图例 五、蛋白质磷酸化的定量分析 蛋白质磷酸化的定量问题，即磷酸化蛋白质与其相应非磷酸化蛋白质的比例，也是蛋白质组研究非常关心的问题。 下面介绍一种稳定同性素标记磷酸化蛋白质定量的方法。 15N稳定同位素标记法 将两种细胞在不同的培养基中分别培养，一种为正常培养基，另一种培养基的氮源有15N提供，混合两种培养物，提取细胞蛋白。分离目标蛋白质(磷酸化蛋白)后，酶解，提取肽段，用质谱分析。因为两种细胞蛋白分别掺入14N和15N ，所以在质谱图中，每个水解肽段表现为一对峰。 14N/15N的同位素丰度比可以体现出两种细胞来源蛋白质表达量的相对水平。 六、小结 目前，现有的磷酸化蛋白质研究手段还不能满足研究的需要，尤其是对微量磷酸化蛋白的富集、鉴定、磷酸化的定量，还需要更持异地富集磷酸化蛋白和磷酸肽的方法。磷酸化修饰是蛋白质组研究中一个非常重要的内容，蛋白质磷酸化与其功能密切相关，所以磷酸化蛋白质组研究都应在一定的功能环境下研究磷酸化蛋白，例如在某一信号转导通路内或在某种外界刺激下细胞蛋白质磷酸化的变化。 第二节 糖基化蛋白质的鉴定 糖蛋白在各种生命现象中起着重要的作用。如：细胞识别、信号传导、免疫与应答、分化与反