研究生仪器分析-液相色谱.ppt

一、色谱的起源 ★1903年，俄国植物学家Tswett研究植物叶子组成，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜色六条色带，他把这种色带称为“色谱”。1906年，发表于德国植物学杂志，属于液固色谱法。 ★色谱的发展： 1940年，液液分配色谱 1941年，气相色谱可能性 1944，纸色谱 1949，薄层色谱 1952，气相色谱 60年代，HPLC 二、高效液相色谱法的优点 （1）分离效能高 （2）选择性高 （3）检测灵敏度高 （4）分析速度快 三、高效液相色谱法的分类 按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类 ★吸附色谱 ★分配色谱 ★离子色谱 ★体积排阻色谱 ★亲和色谱 按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较 四、高效液相色谱结构及流路介绍 （一）流动相 （二）高压输液泵及梯度洗脱装置 （三）进样装置 （四）色谱柱 （五）检测器 （一）流动相 需过滤（一般0.45um膜） 膜：水膜/油膜 脱气： 吹氦脱气法；加热回流法；抽真空脱气法；超声波脱气法；在线真空脱气法 关于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第三种溶剂来调和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。?环已烷 :-0.2、石油醚（Ⅰ类，30~60℃）、石油醚（Ⅱ类，60~90℃）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷: 3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈: 5.8、乙酸:6.0、水:10.2? （二）泵 为什么需要泵？（压力问题） 低压梯度（外梯度） 高压梯度（内梯度） （三）进样装置： 停流进样装置（压力15MPa） 六通阀进样装置（＊） 自动进样器（＊） 使用手动进样器时要注意以下事项： 1 进样针：应选用液相专用的平头针。 2 进样量：要么小于定量环体积的一半，要么满刻度进样（需要推进3～5倍定量环体积的样品） 3 进样动作：在load状态下推针，动作要平缓，以防样品冲出。进样后先切换到inject状态再拔针，以防倒吸或产生气泡。 4 清洗进样口：在inject状态清洗进样口，在load状态清洗定样环。 5 废液口：废液管的出口末端应与进样口水平，以防样品倒流泄漏或产生虹吸 （四）色谱柱 柱填料（＊） 保护柱 柱温控制（柱温箱）（＊） 标准分析中再现保留时间；提高分辨率；高分子化合物或粘性大的样品室温；生物活性的生物分子室温；二维色谱 （五）检测器 按检测的对象分： 整体性质检测器：RID----折射率 ECD ----电导率 噪声大，不适合痕量分析和梯度洗脱 溶质性质检测器：UVD FLD（荧光检测器） 流量和温度不敏感，但不能使用有紫外吸收的流动相，可用于痕量分析和梯度洗脱 按适用性分类： ★选择性检测器：UVD,FLD,ECD ★通用型检测器： RID ※非破坏性检测器：UVD,FLD,ECD, RID ※破坏性检测器：荧光检测器 检测器的性能指标 噪声 基线漂移 灵敏度（最小检出浓度或最小检出量）： 性噪比＝2时，单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量。 线性范围 1、UVD 固定波长紫外吸收检测器 可变波长紫外吸收检测器 光二极管阵列检测器（PDAD） 可变波长紫外吸收检测器，由于可选择的波长范围很大，既提高了检测器的选择性，又可选用组分的最灵敏吸收波长进行测定，从而提高了检测的灵敏度。 还有停泵扫描的功能，可绘出组分的光吸收谱图，以进行吸收波长的选择。 2、RID－－用于糖类测定等 3、ECD 电导率的变化 ★是一种选择性检测器，用于检测阳离子或阴离子，在离子色谱中获得广泛应用。 ★电导率随温度变化，因此测量时要保持恒温。 4、荧光检测器 ★是利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行检测的。是一种具有高灵敏度和高选择性的检测器。 ★不产生荧光的物质，可与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。 ★用于药物分析等。 5、蒸发光散射检测器 雾化过程；流动相蒸发过程；检测过程 消除溶剂的干扰和因温度变化引起的基线漂移，特别适合于梯度洗脱。 液相色谱与气相色谱的比较 HPLC使用前的准备 开始前应知道 1 样品的性质 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量，pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 2 分离目的 样品的性质