生物化学大实验12-ELISA.ppt

多克隆鼠抗AKP抗体的检测-ELISA 实验报告（每组一份，电子版与打印版） 实验总结、感想与建议（每人一份） 实验记录（每人一份） 截止日期：6月30日 * * 2008年春季学年·研究生班 佟丽 包被特异性抗原： 包被液稀释AKP至20μg/mL 每凹孔加200μL 加盖置37℃ 2个小时..................... 实验安排 实验安排 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl ---- 200 μl 200 μl 抗原用量 AKP (20 μg/ml) 1 2 --- 7 8 9 10 11 抗原 孔号 … 12 蛋白质的免疫检测技术 利用抗原－抗体作用的亲和层析 免疫扩散与免疫电泳 免疫印迹（Westren Blotting）技术 酶联免疫吸附测定 免疫沉淀技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 一、基本原理 利用抗原与抗体的特异反应，将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） 酶联免疫吸附测定法（ELISA） E 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 抗原（抗体）结合在固相载体上（保留其免疫活性） 与酶偶联的抗体（抗原）（保留免疫活性与酶活性） 加上酶的相应底物 特定吸光特性的产物进行定性和定量检测 + 膜 蛋白 一抗 HRP HRP HRP HRP 酶标二抗 H2O ２DAB-H + H2O2 ２DAB + 显色 (四甲基二氨基联苯氨) ELISA的种类和变化 （一）直接法 （二）间接法 (三）双抗体夹心法 （四）竞争法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固定后的抗原结合的抗体，故称为间接法。 间接法 酶联免疫吸附测定法（ELISA） Bound primary antibody Enzyme linked To secondary antibody Colored product Support Target molecule Antigenic site E E Seconbody antibody E E Colorless substrate 间接法 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 酶联免疫吸附测定法的特点 特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 酶联免疫吸附测定法的特点 例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗原（HBcAg），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 因ELISA操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng(10-9g)至pg(10-12g)，所需仪器设备简单，而成为生物化学，临床医学检验中应用最广泛、发展最快的检测技术之一。尤其是在单克隆抗体技术中，为阳性杂交瘤细胞株的筛选提供了简便、快速的检测手段。 酶联免疫吸附测定法的特点 ELISA试剂盒 酶联免疫吸附测定法（ELISA） DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 实验部分 实验安排 包被特异 性抗原 封闭 加抗体 加酶标抗体 显色 终止反应 检测