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实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分离血清蛋白质 目的 1 强化学生对电泳基本原理的理解与记忆。 2 熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理、学会操作。 原理 带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。混合物中各组分在电场中的泳动速度，首先和本身所带的净电荷多少、分子量大小和形状有关。一般来说，带电越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 区带电泳的分类 1．按支持物物理性状不同，可分为： (1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 (2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。 2．按支持物的装置形式不同，可分为： (1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳。 (3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。 3．按pH的连续性不同，可分为： (1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 (2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚合反应常用的催化剂有过硫酸胺及核黄素。为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，且可通过控制Acr的浓度或Acr与Bis的比例合成不同孔径的凝胶，以适用于分子大小不同物质的分离。 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂） →聚合 催化剂：过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） 改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径 SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。下面就SDS的基本原理做简单介绍。 SDS－PAGE电泳的基本原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，向阳极移动。 图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 胶槽1 2 3 注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白 得到同行专家赞 蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000KD到200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。 分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类： 1. 连续系统 2.不连续系统：不连续电泳含两层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液。 浓缩胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液 分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓冲液 本实验采用SDS对血清蛋白进行分离，考马斯亮蓝R-250染色，经脱色后，观察其组成和相对含量(血清蛋白通过SDS一般可分出12-16条区带)。 实验试剂和器材 1.高分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200兔肌动蛋白 MW=43,000牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋