抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定.docVIP

抗牛型结核分支杆菌单克隆抗体的制备和鉴定 1　材料和方法 1.1　材料 1.1.1　抗原　牛结核杆菌，筛选抗原用牛结核杆菌的超声波裂解液. 1.1.2　试验动物　6~8周龄的雌性Balb/c小鼠, 1.1.3　主要试剂　DMEM培养液,添加剂HTA液,融合剂PEG(分子量1000),鼠Ig亚类鉴定试剂,小牛血清 1.2　方法 1.2.1 动物免疫　将牛结核杆菌用生理盐水稀释成109个/ml.用等量的菌液和弗氏完全佐剂乳化均匀后,以背部、皮下、腹股沟多点进行基础免疫,间隔21 d,改为弗氏不完全佐剂进行追加免疫,于融合前3 d,经腹腔进行加强免疫.测小鼠抗体效价,选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合. 1.2.2　细胞融合　按常规方法[1].脾细胞与Sp2/0细胞的比例为10∶1,融合剂为50 %PEG.融合后的细胞悬液,加入含有HAT的DMEM培养液,分别加入到6块96孔培养板中,置于5 %CO2,37℃恒温培养箱中进行培养. 1.2.3　抗体筛选　采用间接ELISA法筛选[2].将牛结核杆菌的超声波裂解液作1∶500倍稀释,包被酶标板,每孔100μL,37℃反应2 h,4℃过夜,次日用封闭液封闭.筛选时,将100μL培养上清液加入到已包被好抗原的酶标板中,37℃反应0.5 h,洗涤4次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体,每孔50μL,37℃反应0.5 h,洗涤4次,再加入底物(TMB)显色,每孔100μL,并用2 mol/L H2SO4终止,每孔50μL,在酶标仪上测定OD450值.交叉反应和腹水效价的测定也用ELISA间接法. 1.2.4　克隆培养及抗体制备　将牛结核杆菌超声波裂解液包被板检测阳性的杂交瘤细胞,用有限稀释法进行克隆化培养.当细胞生长至铺满孔底1/4~1/3时,再用同样方法进行检测,选择阳性值高的单克隆细胞株进行再克隆,直至阳性率达到100 %. 1.2.5　杂交瘤细胞的扩大培养　将杂交瘤单克隆细胞株经过几次克隆,阳性率达到100 %后,将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中,再由24孔板转入细胞培养瓶中进行扩大培养[3]. 1.2.6　杂交瘤细胞的冻存　杂交瘤细胞进行扩大培养后,一部分进行小鼠的腹腔注射,体内生产腹水;另一部分可进行冻存.将传代过程中生长良好的细胞,用吸管将细胞轻轻吹下来,1 000 r/min,离心10 min,弃去上清液,加入冻存液1 ml,然后将细胞悬液移入2 ml冻存管中.在外面注明细胞名称及冻存日期.在液氮罐口放10 min,再下放10 min,30 min到达液面.在液面放30 min后,进入液氮面以下[4]. 1.2.7　单克隆抗体的大量制备　将BALB/C小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡(高压灭菌),7~10 d后腹腔注入1×106~5×106个杂交瘤细胞,注射后7~10 d可见小鼠腹部明显膨大,进行无菌操作采集腹水.用吸管收取腹水,1 000 r/min离心10 min,弃去最上层的脂肪层,收集中间层液体,即为单克隆抗体腹水,-20℃冻存备用.离心沉淀物可用生理盐水悬浮,进行细胞计数,按每只小鼠1×106~5×106个杂交瘤细胞,进行小鼠的腹腔注射,进行小鼠体内腹水的扩大化生产. 1.2.8　单克隆抗体的纯化　用饱和硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体.将收集的腹水6 mL加入0.9 %NaCl 18 mL,再加入24 mL饱和硫酸铵(50 %硫酸铵)于4℃下放置1 h,然后以8 000 r/min离心30 min,弃上清;用0.9 %NaCl 6 mL溶解沉淀加入5 mL饱和硫酸铵(45 %硫酸铵),4℃放置1 h,然后以8 000 r/min离心30 min,弃上清;用0.9 %NaCl 4 mL溶解沉淀.将饱和硫酸铵沉淀法纯化收集的抗体上S-300进一步进行纯化.首先对柱子进行处理,把柱子里面的填料用玻璃棒捣入烧杯中,用2 mol/L的NaCl把柱子冲洗干净,然后用2 mol/L的NaCl处理30 min.除去上清中的一些杂质,然后用吸管把填料混匀后加入到柱子中,用0.9 %NaCl平衡2 h(流速3 mL/min,压力0.2 MPa).待柱子稳定后上样.将平衡好的柱子拧开后,用吸管将蛋白沿管壁旋转上样.待样品下降到填料中时,再加一点0.9 %NaCl于柱子中(流速0.7 mL/min,压力0.2 MPa). 1.2.9　ELISA叠加试验　按常规方法进行[5].将纯化的4C3抗体加入已包被好的牛结核杆菌超声波裂解液的抗原板中,37℃作用0.5 h,洗板后再加入5D4抗体,37℃作用0.5 h,然后加入用HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃作用0.5 h,洗板.再加入底物反应10 min.最后用2 mol/L的H2SO4进行终止,用酶标仪检测OD450.用同样的抗原板按类似