外周血染色体标本制作概要.ppt

人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype 在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中加有PHA）后72小时，合成DNA的细胞占总数的45％，有丝分裂的速率相当于每小时1%，被激活的淋巴细胞占总数的90%，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时期。 从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂及相关注意事项详述如下。 1.纺锤体抑制剂 1.1基本原理和机制 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更为清楚。 1.纺锤体抑制剂 细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微管蛋白和β微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝。α微管蛋白与β微管蛋白在化学结构上极为相似，两者42%序列相同。其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。 1.纺锤体抑制剂 故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有效的。 1.纺锤体抑制剂 1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 秋水仙素 秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中提取出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。 秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体的形成。?在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一，长的染色体比短的染色体浓缩得更明显些。 从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标本。 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地区的夏季，那怕气温高达43.3℃，对秋水仙素的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存在8-9℃的组织中，发现中期细胞的数目比保存在室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色体的结构也很清楚。 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有秋水仙素的1/30一1/40。4-6×10-6的浓度即可得到所希望的效应。 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。 1.3处理过程 培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）