2012年qPCR原理与分析方法PPT.ppt

― qPCR系统;内容概要;实时定量PCR技术的概念;实时荧光定量PCR技术涉及的概念 ;扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;横轴：PCR反映循环数;Ct值定量数学原理;Ct值定量数学原理;Ct值定量数学原理;Cycle number;;;非特异性荧光标记： 1.SYBR Green 特异性荧光标记： 2.TaqMan 3.Molecular Beacon;TaqMan---水解型杂交探针;TaqMan探针工作原理; 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成;SYBR Green 法反应示意图;; 几种方法的应用比较; 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物;Sample;将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确;SYBR法实验流程及注意事项;样品制备;样品制备;RT;模板准备;反应体系优化;技能要求;数据分析;;绝对定量简介;绝对定量简介;扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=10－1/斜率，理论的扩增效率理论值应该为2，即每 一个循环的PCR产物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，优化的标准曲线斜率应该为－3.32 E用每个循环扩增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％ 例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循环有95％模板被扩增 ;绝对定量举例：HBV病毒检测;标准曲线制作举例;标准曲线制作举例;;分析方法： 2 － △Ct 2 － △△Ct Pfaffi法;2－△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化;2－△△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化;Pfaffi法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化;荧光定量常见问题分析