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-80℃冷冻管制备（验证） 细菌的状态：非指数生长期 细菌的浓度： 108到1010每毫升 如果浓度不够可以离心浓缩 冷冻管的装量：1ml、2ml、3ml 4ml、5ml 一批冷冻管的数量：一盒、二盒 非常关键： 4℃，－20℃，－40℃， －80℃转移时的操作 冷冻管盒冰箱位置、冰箱装量等 -80℃菌种保藏操作过程的问题 -80℃冰柜的存放样品 避免温度变化：不良习惯有A长时间打开柜门找样品B一次性放入大量冷冻管C经常将同一盒冷冻管拿出来等等 温度变化：水的膨胀系数、冰的膨胀系数 正确是慢冻、快融，每一次循环都有损伤慢融、速冻更不好，对存活率影响很大 -80℃冷冻管制备的验证 冷冻管的数量、每只冷冻管的装量。 制备冷冻管细胞的最佳状态和周期：一级？二级？斜面？ 冷冻管批内差异、批间差异：取样点 复苏方法：1、2、4、 8只操作是否一样？ 操作如何保证降温 速度基本一致？ 微生物纯种分离方法 平板划线分离 将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。 微生物纯种分离方法 液体稀释法 将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。例如： 利用选择培养基进行分离 不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。例如：811 菌丝尖端切割 这种方法适于丝状真菌。用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落。 单细胞诱变 最后分布（单细胞，一个突变） 菌丝体的情况（三个细胞或核） 最后单菌落的分布（三个细胞） 相关文件 正确分离单菌落的策略 边缘部分纯的概率比较大 中心肯定不纯 整个菌落肯定也不纯 以前切边缘取中心或全取的方法不是最佳 正常分离：每个菌落挑一个或两个边缘，划线 诱变分离：每个菌落挑三个边缘，划线 选育中常见错误假设 菌落大=个头大 菌落外观丰满=菌落健康 摇瓶效价高=生产能力强 只看摇瓶效价增长，不看蒸发量的比例 致死率高好 直接套用其他品种的方法 对于高产罐，从发酵罐取样进行罐分是有效的提高生产能力的自然选育方法 谢谢大家！ 菌种的传代、保藏分离 2012-10-18 标准菌种的概念及其管理 标准菌种是指由权威机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。 我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供 美国ATCC、NRRL，荷兰的CBS 微生物菌种的使用、保存与管理、验证 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚. （2）菌种的接收与复活 标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。 菌种的传代 菌种的复苏 菌种的确认 菌种的接种 菌种的保藏 菌种的复苏 《中国药典》2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。 相关文件定义（美国药典） 严格控制菌种的传代 避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。 1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代） 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管 ，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代） 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验 4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代） 5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。 6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接转接第四代，直至四代转为五代。 菌种保藏标签的规范与要求 菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。 一旦新