微生物细胞的破碎技术概要.ppt

第3章 微生物细胞的破碎 2. 细胞壁的组成和破碎阻力 各种微生物细胞壁的结构与组成 3.微生物细胞的破碎技术 高压匀浆法 高压匀浆法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片细小，胞内物质释放完全 适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎效果较差 影响因素 操作压力（50～70MPa） 细胞浓度（20％） 温度 循环次数(2~5) 高压匀浆器 珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 高速珠磨机 珠磨法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片较小，胞内物质释放完全 温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类 影响细胞破碎的因素 搅拌速度（700～1450r/min） 料液的循环速度（50～500L/h） 细胞浓度（0.3～0.5g/mL） 珠粒大小和填充量 （0.45～1mm；70％～90％) 电声超声波发生器 机械破碎法与非机械法比较 4 破碎方法的选择 破碎率的测定 破碎技术的新进展 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和RNA聚合酶。 包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间折叠错误，故没有生物活性。 包含体形成的原因 缺少某些折叠的协助因子; 局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键; 包含体蛋白表达速度过快，表达量过高 包含分离的工艺路线 机械破碎 离心提取包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性 化学破碎，溶解包含体（加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 包含分离的工艺路线 机械破碎 洗滤去除可溶杂质 加变性剂溶解 除变性剂复性 除变性剂复性 机械破碎 加低浓度变性剂洗滤 洗滤去除可溶杂质 加变性剂溶解 * 知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。 难点：常用破碎方法的合理选用。 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等 1. 微生物细胞的破碎技术概述 细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。 丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂 超声波法 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体积 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。 化学法 化学法 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂 酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有胆酸盐、磷脂、SDS、CTAB、 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 化学法 优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故使用较多。 缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难 总结：①酸碱容易造成产物水解或变性，慎用； ②表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合于绝大部分非蛋白类的物质； 酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性