CN107312743-CN201710460514-一种牙龈上皮模型及其体外构建方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107312743 A (43)申请公布日 2017.11.03 (21)申请号 201710460514.9 (22)申请日 2017.06.18 (71)申请人 广东博溪生物科技有限公司 地址 523808 广东省东莞市松山湖高新技 术产业开发区台湾高科技园桃园路1 号莞台生物技术中心合作中心1栋1楼 08室 (72)发明人 何欣　李潇　卢永波　 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (54)发明名称 一种牙龈上皮模型及其体外构建方法 (57)摘要 本发明公开一种牙龈上皮模型及其体外构 建方法，其特征是：包括以下方法步骤；步骤一、 牙龈上皮细胞的原代培养及扩增，步骤二、牙龈 上皮细胞液下接种培养，步骤三、牙龈上皮模型 气液面的增殖分化培养本发明使用人源牙龈上 皮细胞的使用，使模型结构及功能更接近正常人 体牙龈上皮组织，能更加真实的反应检测指标； 体外构建重复性佳，可实现产业化制备；气液面 分段培养法，保证了细胞在不同阶段的不同营养 需求，缩短了构建时间、降低生产成本；培养基中 因子的添加，保证了模型的正常复层化，这种自 身结构和细胞外微环境的影响可进一步提升模 A 型的屏障功能，最终构建的体外牙龈上皮模型与 3 人牙龈上皮组织具有高度相似的结构及功能。 4 7 2 1 3 7 0 1 N C CN 107312743 A 权　利　要　求　书 1/1 页 1.一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：包括以下方法步骤； 步骤一、牙龈上皮细胞的原代培养及扩增 将正常人牙龈组织经处理获得单细胞悬液，加入角化细胞无血清培养基重新悬浮细 胞，转至培养瓶中；然后使用P4 P20代细胞，培养液Ⅰ中培养，然后以胰酶消化制成单细胞悬 ~ 液，置于37℃、5%CO 条件下培养进行扩增； 2 步骤二、牙龈上皮细胞液下接种培养 使用步骤一中扩增后的P4 P20代细胞，以培养液 Ⅱ制成单细胞悬液，进行接种后培养 ~ 1-5小时后再转入液下培养； 步骤三、牙龈上皮模型气液面的增殖分化培养 将上述液下培养中的培养液弃掉，更换为培养液Ⅲ，进行气液面培养，再更换为培养液 Ⅳ，继续进行气液面培养，最后更换为培养液Ⅴ，继续进行气液面培养，培养结束，牙龈上皮 模型的体外构建结束。 2.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液 Ⅰ，为DMEM，其所含葡萄糖含量为1.0～4.5g/L，谷氨酰胺含量为1.0～10.0mM。 3.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液 Ⅱ，为在培养液Ⅰ中，添加人表皮生长因子浓度为0.1～150.0 ng/mL，胰岛素浓度为0.1～ 150.0 ng/mL，氢化可的松浓度为0.1～20.0μg/mL，三磷酸腺苷浓度为1.0～150.0μg/mL，转 铁蛋白浓度为1.0～150.0 ng/mL，孕酮浓度为1.0～100.0 nM，对羟基苯甲酸丁酯浓度为 0.1～10.0μg/mL，牛脑垂体浸提物浓度为1.0～100.0μg/mL，腺嘌呤10～100μg/mL，硒酸钠 1.0～50.0 nM。 4.根据权利要求1所述的一种牙龈上皮模型及其体外构建方法，其特征是：所述培养液 Ⅲ，为在培养液Ⅱ