CN106939300-CN201710280569-树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 106939300 A (43)申请公布日 2017.07.11 (21)申请号 201710280569.1 (22)申请日 2017.04.26 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:C201740 2017.03.16 (71)申请人 中国医学科学院医学生物学研究所 地址 650035 云南省昆明市茭菱路935号 (72)发明人 马娜　董少忠　寸韡　 (74)专利代理机构 昆明正原专利商标代理有限 公司 53100 代理人 陈左　于洪 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图2页 (54)发明名称 树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与 应用 (57)摘要 本发明涉及一种树鼩肝细胞永生化细胞系 及其构建方法与应用，属于生物医学技术领域。 该细胞系命名为ITH6.1，保藏于中国典型培养物 保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保 藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉 大学。本发明的ITH6.1永生化树鼩肝细胞系可连 续传代100次后，仍然保持二倍体核型，具备极强 的增殖能力，真正实现了永生化。该细胞有着较 强的增殖能力，进一步对ITH6.1进行蛋白表达、 生化指标等特性分析，结果显示了ITH6.1具有典 型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性 A 检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。 0 0 3 9 3 9 6 0 1 N C CN 106939300 A 权　利　要　求　书 1/1 页 1.树鼩肝细胞永生化细胞系，其特征在于，该细胞系命名为ITH6.1，保藏于中国典型培 养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路 299号武汉大学。 2.权利要求1所述的树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤（1），含SV40TAg基因的重组慢病毒的获得：将表达SV40TAg蛋白的慢病毒表达质粒 和包装质粒共转染293T细胞，包装出含SV40TAg基因的重组慢病毒； 步骤（2），慢病毒感染：在PTH贴壁培养基中将树鼩原代肝细胞培养至其贴壁后，更换为 PTH维持培养基，以树鼩原代肝细胞开始培养时计，24h后按照MOI=2的比例接种步骤（1）得 到的含SV40TAg基因的重组慢病毒，24小时后更换为完全培养液继续培养，得到ITH6细胞； 步骤（3），传代：当步骤（2）培养得到的ITH6细胞接近汇片时进行传代，将ITH6单细胞悬 4 2 液计数后按5 ×10 个细胞/cm 的接种密度接种至包被了鼠尾胶原的培养皿中，用完全培养 基于37℃、5%CO 孵箱中静置培养3-5天，经有限稀释法挑选单克隆细胞株后，得到树鼩肝细 2 胞永生化细胞系ITH6.1； 其中所述的PTH贴壁培养基包含如下组分：以1号灌流液为溶剂，II型胶原酶50mg/L、IV 胶原酶50mg/L、质量浓度为17%氯化钙水溶液1ml/L；所述的1号灌流液包含如下组分：氯化 钠  160.8 mmol/L、氯化钾 3.15 mmol/L、磷酸氢二钠0.7 mmol/L、HEPES 33 mmol/L。 3.根据权利要