莱茵衣藻缺铁应答调控基因femu2p.doc

文章编号：1674-7054（2013）00-0000 一种快速简便鉴定Femu2p-C2H2蛋白与TTGGGT BOX相互作用的EMSA实验方法 费小雯吴小霞邓晓东 （1.海南医学院 基础医学部海南 海口 571101中国热带农业科学院 热带生物技术研究所海南 海口 571101） 分析了EMSA技术研究进展及优缺点，并在此基础上进行实验方法改进。通过检测TTGGGT Box及其突变体与Femu2p-C2H2蛋白的相互作用，探索并总结出一套快速、简便、经济适用的EMSA实验法，该方法可用于DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的特异性竞争反应分析。 EMSA实验法；Femu2p-C2H2蛋白；TTGGGT Box；特异性竞争反应 凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay -EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析，是目前检测核转录因子最常用的方法[1]。传统的电泳迁移率实验为放射性EMSA[2]，随着化学和分子生物学技术的发展，先后出现了使用地高辛或生物素标记DNA探针的化学发光EMSA[3-5]，荧光染料标记DNA或对凝胶中的DNA或蛋白质进行荧光染色的荧光EMSA[6-7]，以及最新的用近红外荧光素Cy5.5 、Cy7、IRDye680、IRDye800CW标记DNA的近红外荧光（near-infrared fluorescence，NIRF）EMSA（NIRF-EMSA）[8-10]。这些技术虽然灵敏性高，但是，具有放射性污染、稳定性差、操作繁琐成本较高。因此探索操作简便经济有效的EMSA技术。本实验以验证Femu2p-C2H2蛋白与其相关的DNA结合序列相互作用为例，介绍一种快速有效，经济适用的EMSA实验法。1 材料与方法 Femu2p-C2H2蛋白本实验室保存。2）原始序列TTGGGT Box本实验室通过PCR中介随机筛选得到3）DNA结合缓冲液试剂——poly（dI-dC）牛血清白蛋白(BSA)苯甲基磺酰氟（PMSF）HEPES（pH7.5）KCl，ZnSO4，MgCl2，Nonidet-40（NP-40）二硫苏糖醇(DTT)甘油非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native）试剂——丙烯酰胺过硫酸铵（APS）Tris，EDTA，硼酸TEMED，溴酚蓝（BPB）Goldview等试剂的购买上海生工生物工程技术服务有限公司序列合成在上海生工。电泳仪及电泳槽购自美国Bio-Rad公司。 将5对单链（Box1-p1和 Box1-p2，Box2-p1和Box2-p2，Box3-p1和Box3-p2，Box4-p1和Box4-p2，Box5-p1和Box5-p2）分别等量混合，95 ℃变性5 min，自然冷却至室温形成5个双链Box（Box1～Box5）。 2013-08-21 基金项日： 作者简介： 通信作者： 表1 EMSA实验检测Femu2p-C2H2蛋白结合用寡聚核苷酸序列 Tab.1 补充英文？ 名称 序列 Box1 Box1-p1 5’-TTGGGT TTGGGT TTGGGT TTGGGT-3’ Box1-p2 5’-ACCCAA ACCCAA ACCCAA ACCCAA-3’ Box2 Box2-p1 5’-CCGGGT CCGGGT CCGGGT CCGGGT-3’ Box2-p2 5’-ACCCGG ACCCGG ACCCGG ACCCGG-3’ Box3 Box3-p1 5’-TTAAGT TTAAGT TTAAGT TTAAGT-3’ Box3-p2 5’-ACTTAA ACTTAA ACTTAA ACTTAA-3’ Box4 Box4-p1 5’-TTGGAC TTGGAC TTGGAC TTGGAC-3’ Box4-p2 5’-GTCCAA GTCCAA GTCCAA GTCCAA-3’ Box5 Box5-p1 5’-TTAAAT TTAAAT TTAAAT TTAAAT-3’ Box5-p2 5’-ATTTAA ATTTAA ATTTAA ATTTAA-3’ 1.2.2 双链Box与Femu2p-C2H2蛋白的结合实验 将双链Box1分别与10，20，30，40 ug的Femu2p-C2H2蛋白混合（以GST蛋白作为对照），并在混合体系中加入1/10体积的DNA结合缓冲液，22 ℃结合反应20 min。加入1 u 10×DNA Loading Buffer，上样于预先制备好并冷却的8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶[11]，在冰上100 V电泳至Loading Buffer带至胶板2/3处（约