原位杂交试验原理与方法一-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.18.15 原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺 点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry ；ISHH ）属于 分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标 记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂 交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基 互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得 到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核 酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成 杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目 前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入 DNA 中，常用的同 位素标记物有 3H、35S、125I 和 32P 。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为 清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位 素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为 DNA 探针、cDNA 探针、cRNA 探针和合 成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链 cDNA 探针和单链 cDNA 探针。 原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization ） 菌落原位杂交是将细菌从培养 平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出 DNA 。将NDA 烘干固定于膜上与 32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平 板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization ） 组织原位杂交简称原位杂交，指 组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释 出 DNA ，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让 中国试剂网 3.18.15 探针进入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交。 （一）探针的选择 根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择 克隆的 DNA 或 cDNA 双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针 如寡核苷酸探针和 RNA 探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用 寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的 DNA 单链探针（通过克 隆人M13 噬菌体 DNA 获得）或 RNA 探针，寡核苷酸探针也可。长的双链 DNA 探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体 ，但不适宜于组织原 位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针 和短的 PCR 标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。 在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立 DNA 文库时，手头 没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯 化该基因的编码蛋白，并测定 6 个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序 列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物 间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因 作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针 时，可采用 PCR 方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得 到自己的探针。这种方法十分简便，无论基因组 DNA 探针还是 cDNA 探针都可 以容易地获得，而且，可以建立 PCR 的基因检测方法，与探针杂交方法可作对 比，可谓一举两得。 （二）探针的标记方法 在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么 标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑 实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵 敏度高。放射性探针