分子生物学试验设计基础.pdfVIP

分子生物学实验（上游） 分子生物学实验设计基础 ECUST Light harvester iGEM 2017 present For team SUIS_Alpha_Shanghai 1 分子生物学实验（上游） 摘要 基因工程（genetic engineering ）又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗 传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按 预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗 传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了 有力的手段 2 分子生物学实验（上游） 目录 第1 章 前言4 1.1 实验目的和背景4 第2 章 实验流程和原理5 2.1 实验流程5 2.2 实验原理5 2.2.1 外源DNA 和载体的获取6 2.2.2 外源DNA 和载体的酶切和连接6 2.2.3 感受态细胞的制备和转化7 2.2.4 转化子的培养和扩增7 3 分子生物学实验（上游） 第一章 前言 1.1 实验目的和背景 基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪切重组， 然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因 此，供体、受体、载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的 基因属于外源基因重组剪接的载体也都是DNA 分子，因此基因工程亦称为重组DNA 技术。另外，DNA 重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为 分子克隆技术。 4 分子生物学实验（上游） 第二章 实验流程和原理 2.1 实验流程图 PCR 扩增 PCR 产物纯 碱裂解法抽提 目的基因 琼脂糖凝胶 化，琼脂糖凝 质粒 的获取 电泳验证 胶电泳验证 菌落PCR 验证 连接液转 目的基因与 PCR 产物与 阳性，提交测 化，抗性筛 质粒连接 质粒双酶切 序 选 蛋白表达 2.2 实验原理 2.21 外源DNA 和载体的获取 首先通过模板基因组获取目的基因，主要通过PCR 的方法： PCR 技术的基本原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链 或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应 作准备； ②模板DNA 与引物的退火(复性) ：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反 应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复